מכלולים נגד סרטן מתכת: סינתזה וCytotoxicity הערכה על ידי assay MTT
Summary
שיטה לסינתזה של סוכני טיטניום ונדיום נגד סרטן אוויר רגיש מתוארת, יחד עם ההערכה של הפעילות ציטוטוקסיות כלפי שורת תאי הסרטן אנושית על ידי assay MTT.
Abstract
מתחמי טיטניום (IV) ונדיום (V) הם סוכנים אנטי סרטני חזקים מאוד. אתגר בסינתזה שלהם מתייחס לחוסר יציבות hydrolytic, ולכן ההכנה שלהם צריכה להתנהל תחת אווירת אינרטי. הערכה של הפעילות אנטי סרטנית של מתחמים אלה יכול להיות מושגת על ידי assay MTT.
Assay MTT הוא assay כדאיות colorimetric מבוסס על הפחתה האנזימטית של מולקולת MTT לformazan כאשר הוא נחשף לתאי קיימא. התוצאה של הירידה היא שינוי צבע של מולקולת MTT. מדידות ספיגת יחסית לשליטה לקבוע את אחוז שנותר תאים סרטניים קיימא לאחר הטיפול שלהם בריכוזים שונים של מתחם שנבדק, אשר תורגם לפעילות אנטי סרטנית המתחם וIC 50 ערכיה. Assay MTT הוא נפוץ באופן נרחב במחקרי cytotoxicity בשל הדיוק שלו, מהירות ופשטות היחסית.
במסמך זה אנו מראשנשלח פרוטוקול מפורט לסינתזה של תרופות המבוססות על אוויר מתכת רגישה ומדידות כדאיות תא, כולל הכנה של צלחות התא, דגירה של התרכובות עם התאים, מדידות כדאיות באמצעות assay MTT, והנחישות של IC 50 ערכים.
Introduction
כימותרפיה היא עדיין אחד הקורסים העיקריים של טיפולים המועסקים במרפאת למחלות סרטן שונות, ובכך כמות עצומה של מחקר שנערכה ברחבי העולם במטרה לפתח תרופות נגד סרטן חדשים ומשופרות. מחקרים כאלה בעיקר להתחיל ברמה הכימית, עם העיצוב והכנה של תרכובות, ואחריו הערכה ביולוגית של התכונות ציטוטוקסיות במבחנה. כדאיות תא עשויות להיות מוערכות על ידי מבחני שונים המספקים מידע על פעילות תאית 1-2.
ציספלטין הוא דוגמא מורכבת פלטינה כי נעשה שימוש נרחב כתרופה כימותרפית, הנחשבת לטיפול יעיל בעיקר לסרטן אשכים ושחל 3-4. עם זאת, הטווח שלה צר פעילות ותופעות לוואי חמור לעורר מחקרים של קומפלקסי מתכות מעבר חזק אחרים 5-8. בין יתר, טיטניום (IV) ונדיום מתחמים (V) הראו תוצאות מבטיחות של פעילות גבוהה והקטינורעילות 9-16. טי (IV) מתחמים היו הראשונים להיכנס לניסויים קליניים לאחר ציספלטין בשל מאפיינים אלה, עם זאת, הם נכשלו בניסויים בשל קשיי ניסוח וחוסר יציבות hydrolytic. יש אפוא צורך הנוכחי לפתח נגזרים משופרים של מתחמי מתכת אלה שעשויים לשלב פעילות אנטי סרטנית גבוהה עם עמידות למים 15,17-21.
אתגר בהכנה של טי (IV) ו-V (V) מתחמים מתייחס לחוסר יציבות hydrolytic של ריאגנטים המבשר, ולכן, יש לשמור אווירת אינרטי. ההכנה של טי (IV) ו-V (V) תרכובות מתבצעת בתנאי N 2 או אר בתא הכפפות או תוך שימוש בטכניקות שורת Schlenk.
שיטה נפוצה אחת לצורך ההערכה של הפעילות אנטי סרטנית מבוססת על MTT (3 – (4,5-dimethylthiazolyl) רומיד -2,5-diphenyltetrazolium) assay. assay זה assay כדאיות colorimetric שהוצג ב1983 על ידי Mosmann22. הוא מאוד נחקר היטב ומאופיין, והיא נחשבת יעילה ביותר כאשר אנו מעריכים את האפקטיביות של תרכובות ציטוטוקסיות חדשות בשל הדיוק שלו, מהירות, ויכולתה להיות מיושמת במגוון רחב של שורות תאים. assay כדאיות זה מבוסס על שינוי הצבע של מולקולת MTT כאשר הוא נחשף לתאי קיימא. מדידה של הספיגה, שהוא פרופורציונאלי למספר תאי קיימא, והשוואה לקבוצת ביקורת שלא טופלה, מאפשרת הערכה של יכולות עיכוב צמיחת תאים של המתחם שנבדק.
Assay colorimetric MTT מתנהל במתכונת צלחת 96 היטב 23. התאים עשויים לדרוש preincubation בבארות לפני התוספת של התרופה הנבדקת. הפעמים preincubation עשויות להשתנות 0-24 שעה בהתאם למאפייני הקו הסלולרי. תאים בדרך כלל נחשפו לתרופה ל24-96 שעות בהתאם לפעילות התרופה. פתרון MTT הוא הוסיף אז לתאים שטופלו, שבו לצעוקow MTT מצטמצם formazan הסגול על ידי מגוון של אנזימים של המיטוכונדריה וcytosolic כי הם מבצעיים בתאי קיימא (איור 1) 24. מולקולת MTT לא מצטמצמת על ידי תאים מתים או תאי דם אדומים (מטבולית תאים לא פעילים), תאי טחול (תאי מנוחה) ולימפוציטים מגורה concanavalin (תאים הופעלו) 22. אחרי 3-4 שעות של דגירה עם MTT משקעים formazan. היווצרות formazan מתחילה אחרי 0.5 שעות של דגירה, אבל עבור תוצאות אופטימליות עדיף לחשוף את התאים לMTT לפחות 3 שעות 22. כתוצאה מכך, הגידול הבינוני מוסר וformazan הוא מומס בממס אורגני, רצוי isopropanol 25, למרות DMSO יכול לשמש גם 26. חיסולו של המדיום הוא חיוני להשגת תוצאות מדויקות מאז פנול אדום, שהוא נפוץ באופן נרחב במדיום גידול, והאצת חלבונים יכולים להפריע למדידת ספיגת 25. כאשר הפורםפתרון זאן מגיע הומוגנית, הספיגה של הפתרון נמדדת באמצעות ספקטרופוטומטר microplate קורא. הספיגה ב 550 ננומטר עומד ביחס ישר למספר התאים בטווח של 200-50,000 תאים לכל טוב, ולכן ניתן לאתרם כמויות קטנות מאוד של תאים 22. הספיגה מציינת את כמות תאי קיימא שנותרה לאחר טיפול בתרופה, והוא לעומת הספיגה של תאי בקרה שלא נחשפו לתרופה. ניתוח התוצאות על ידי תוכנה מתאימה מספק (ריכוז עיכוב; 50%) IC 50 ערכים והשגיאות הסטטיסטיות שלהם מבוססים על מספר חזרות של המדידה.
Assay MTT הוא נפוץ באופן נרחב במחקרי cytotoxicity להקרנת תרכובות אנטי סרטניות חדשות, בשל דיוקה ופשטות יחסית. עם זאת, בעת שימוש assay MTT, אשר היה תלוי בתגובה האנזימטית, יש לקחת בחשבון כי מעכבי אנזים שונים יכולים להשפיע על ההפחתה של MTTd להוביל לתוצאות שגויות 27. בנוסף, assay MTT אינו מספק כל מידע על המנגנון המולקולרי של הפעילות ציטוטוקסית של התרופה 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת בכתב היד הזה משלבת סינתזה כימית עם assay כדאיות תא ביולוגי. כמו בכל שיטות ביולוגיות הנוגעות לתאי קיימא, הוא חיוני לעבודה בברדס למינרית, ולשמור על תנאים סטריליים, כוללים השימוש בממסים אורגניים סטרילי. כמו כן, הכנה ואחסון של תרופות על בסיס לא יציבה hydrolytically מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון התקבל ממועצת המחקר האירופית במסגרת התכנית של הקהילה האירופית מסגרת השביעית (FP7/2007-2013) / הסכם גרנט ERC אין [239,603]
Materials
| Reagent/Material | |||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Hexane AR | Gadot | 830122313 | Dried using a solvent drying system |
| HT-29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| Isopropanol AR | Gadot | 830111370 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M5655-1G | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | Biological Industries | 03-031-1B | |
| RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| RPMI without phenol red | Biological Industries | 01-103-1A | |
| Tetrahydrofuran (THF) AR | Gadot | 830156391 | dried using a solvent drying system |
| Ti(OiPr)4 | Sigma-Aldrich | 205273-500ML | moisture sensitive |
| Trypsin/EDTA | Biological Industries | 03-052-1B | |
| VO(OiPr)3 | Sigma-Aldrich | 404926-10G | moisture sensitive |
| Equipment | |||
| 12-channel pipette 30-300 μl | Thermo Scientific | ||
| 12-channel pipette 5-50 μl | Finnpipette | ||
| 75 cm2 flask | NUNC | 156472 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | NUNC | 167008 | |
| CO2 Incubator | Binder | APT.line C150 | |
| Counter chamber | Marienfeld-Superior | 650030 | |
| Eppendorf vial | KARTELL | ||
| Glove box | M. Braun | ||
| Laminar flow hood | ADS LAMINAIRE | OPTIMALE 12 | |
| Microplate reader spectrophotometer | Bio-Tek | El-800 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Pipette 20-200 μl | Finnpipette | ||
| Pipette 5-50 μl | Finnpipette |
References
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opinion on Drug Discovery. 3, 655-669 (2008).
- Hatok, J., et al. In vitro assays for the evaluation of drug resistance in tumor cells. Clinical and Experimental Medicine. 9, 1-7 (2009).
- Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).
- Muggia, F. Platinum compounds 30 years after the introduction of cisplatin: Implications for the treatment of ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 112, 275-281 (2009).
- Bruijnincx, P. C., Sadler, P. J. New trends for metal complexes with anticancer activity. Current Opinion in Chemical Biology. 12, 197-206 (2008).
- Ott, I., Gust, R. Non platinum metal complexes as anti-cancer drugs. Archiv der Pharmazie (Weinheim. 340, 117-126 (2007).
- Desoize, B. Metals and metal compounds in cancer treatment. Anticancer Research. 24, 1529-1544 (2004).
- Jakupec, M. A., Galanski, M., Arion, V. B., Hartinger, C. G., Keppler, B. K. Antitumour metal compounds: more than theme and variations. Dalton Transactions. , 183-194 (2008).
- Meléndez, E. Titanium complexes in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 309-315 (2002).
- Evangelou, A. M. Vanadium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 249-265 (2002).
- Djordjevic, C. Antitumor activity of vanadium compounds. Metal ions in biological systems. 31, 595-616 (1995).
- Caruso, F., Rossi, M., Pettinari, C. Anticancer titanium agents. Expert Opinion on Therapeutic Patents. 11, 969-979 (2001).
- Caruso, F., Rossi, M. Antitumor titanium compounds. Mini-Review in Medicinal Chemistry. 4, 49-60 (2004).
- Kostova, I. Titanium and vanadium complexes as anticancer agents. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 9, 827-842 (2009).
- Tshuva, E. Y., Ashenhurst, J. A. Cytotoxic Titanium(IV) Complexes: Renaissance. European Journal of Inorganic Chemistry. , 2203-2218 (2009).
- Buettner, K. M., Valentine, A. M. Bioinorganic Chemistry of Titanium. Chemical Reviews. 112, 1863-1881 (2012).
- Meker, S., Margulis-Goshen, K., Weiss, E., Magdassi, S., Tshuva, E. Y. High antitumor activity of highly resistant salan-titanium(IV) complexes in nanoparticles: an identified active species. Angewandte Chemie International Edition in English. 51, 10515-10517 (2012).
- Reytman, L., Braitbard, O., Tshuva, E. Y. Highly cytotoxic vanadium(V) complexes of salan ligands; insights on the role of hydrolysis. Dalton Transactions. 41, 5241-5247 (2012).
- Tzubery, A., Tshuva, E. Y. Cytotoxicity and Hydrolysis of trans-Ti(IV) Complexes of Salen Ligands: Structure-Activity Relationship Studies. Inorganic Chemistry. 51, 1796-1804 (2012).
- Tshuva, E. Y., Peri, D. Modern cytotoxic titanium(IV) complexes; Insights on the enigmatic involvement of hydrolysis. Coordination Chemistry Reviews. 253, 2098-2115 (2009).
- Shavit, M., Peri, D., Manna, C. M., Alexander, J. S., Tshuva, E. Y. Active cytotoxic reagents based on non-metallocene non-diketonato well-defined C-2-symmetrical titanium complexes of tetradentate bis(phenolato) ligands. Journal of the American Chemical Society. 129, 12098-12099 (2007).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival – Application to Proliferation and Cyto-Toxicity Assays. Journal of Immunological Methods. 65 (83), 55-63 (1983).
- Ahmadian, S., Barar, J., Saei, A. A., Fakhree, M. A. A., Omidi, Y. Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay. Journal of Visualized Experiments. (26), e1191 (2009).
- Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology in Vitro. 15, 257-259 (2001).
- Denizot, F., Lang, R. Rapid Colorimetric Assay for Cell-Growth and Survival – Modifications to the Tetrazolium Dye Procedure Giving Improved Sensitivity and Reliability. Journal of Immunological Methods. 89, 271-277 (1986).
- Alley, M. C., et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. 암 연구학. 48, 589-601 (1988).
- Weyermann, J., Lochmann, D., Zimmer, A. A practical note on the use of cytotoxicity assays. International Journal of Pharmaceutics. 288, 369-376 (2005).
- Chmura, A. J., et al. Group 4 complexes with aminebisphenolate ligands and their application for the ring opening polymerization of cyclic esters. Macromolecules. 39, 7250-7257 (2006).
- Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10, 128-134 (2011).
- Yung, W. K. A. In vitro Chemosensitivity Testing and its Clinical-Application in Human Gliomas. Neurosurgical Review. 12, 197-203 (1989).
- McCarthy, N. J., Evan, G. I. . Current Topics in Developmental Biology. 36, 259-278 (1997).
