MTTアッセイにより合成と細胞毒性の評価：抗がん金属錯体
Summary
空気に敏感チタン及びバナジウム抗癌剤の合成のための方法は、MTTアッセイによるヒト癌細胞株に対するそれらの細胞傷害活性の評価と共に、記載されている。
Abstract
チタン（IV）とバナジウム（V）錯体は、非常に強力な抗癌剤である。それらの合成における課題は、それらの加水分解不安定性を意味するので、それらの調製は、不活性雰囲気下で行われるべきである。これらの複合体の抗癌活性の評価はMTTアッセイにより達成することができる。
MTTアッセイは、それが生存可能な細胞に曝露されたときにMTTホルマザンに分子の酵素的還元に基づく比色生存率アッセイである。還元の結果は、MTT分子の色変化である。対照と比較して吸光度測定は、化合物の抗癌活性とそのIC 50値に変換される試験した化合物、様々な濃度の彼らの治療後の生癌細胞を残りの割合を決定。 MTTアッセイはその正確性、迅速性、および比較的単純による細胞毒性試験で広く一般的です。
ここに、我々は事前に細胞プレートの調製、細胞と化合物のインキュベーション後、MTTアッセイを用いて生存率を測定し、IC 50値の決定を含む空気に敏感な金属系薬物および細胞生存率の測定、の合成のための詳細なプロトコルを送った。
Introduction
化学療法は、依然として様々な癌疾患の診療所で採用治療の主なコースの一つであり、研究のこのよう膨大な量の新しい改良抗がん剤の開発を目的とした世界的に行われている。このような研究は、主にin vitroでの細胞毒性の特性の生物学的評価に続いて、化合物の設計と準備して、化学的なレベルで開始します。細胞生存率は、細胞活性1〜2についての情報を提供する様々なアッセイにより評価することができる。
シスプラチンは、広く精巣および卵巣癌3-4向けに効率的な治療法と考えられている化学療法薬として使用される白金錯体の一例である。しかしながら、狭い活性範囲および重篤な副作用は、他の強力な遷移金属錯体5-8の研究を誘発する。中でも、チタン（IV）とバナジウム（V）錯体は、高活性の有望な結果を示し、減少し毒性9月16日 。 TI（IV）錯体は、これらの特性のために、シスプラチンの後に臨床試験に入ることが最初でしたが、それらは、製剤の困難や加水分解不安定に試験を失敗している。耐水性15,17-21高い抗癌活性を組み合わせることができるこれらの金属錯体の改善された誘導体を開発するための電流が必要とされている。
チタン（IV）およびV（V）錯体の調製における課題は、前駆体試薬の加水分解不安定性を指し、従って、不活性雰囲気が維持されるべきである。チタン（IV）およびV（V）化合物の調製は、グローブボックス内またはシュレンクライン技術を用いて、N 2またはAr条件下で行われる。
アッセイ – 抗癌活性を評価するための一つの一般的な方法は、MTT（（4,5 – ジメチルチアゾリ）-2,5 – ジフェニルテトラゾリウムブロミド3）に基づいている。このアッセイは、モスマンによって1983年に発表された比色生存率アッセイである22。それは非常によく研究され特徴付けられ、そして、その精度、迅速性、および種々の細胞株に適用されるその能力に新たな細胞毒性化合物の有効性を評価する際には非常に効率的と考えられているされている。この生存率アッセイは、それが生細胞に曝露されるMTT分子の色の変化に基づいている。生存細胞の数、および未処理の対照との比較に比例した吸光度の測定は、試験した化合物の細胞増殖阻害能力の評価を可能にする。
MTT比色アッセイは、96ウェルプレート形式23で行われる。細胞は、試験した薬剤を添加する前に、ウェル中のプレインキュベーションが必要な場合があります。プレインキュベーション時間は細胞株の特性に応じて0〜24時間と異なる場合があります。細胞は、通常、薬物活性に応じて24〜96時間薬物に曝露される。 MTT溶液を、次いで、エール処理した細胞に添加されOW MTTは生細胞（ 図1）24で動作しているミトコンドリアと細胞質ゾルの酵素の様々な紫色のホルマザンに還元される。 MTT分子は、死細胞又は赤血球（代謝的に不活性な細胞）、脾臓細胞（休止細胞）およびコンカナバリンAで刺激されたリンパ球（活性化細胞）22によって低減されない。 MTTホルマザン沈殿物とのインキュベーションの3〜4時間後。ホルマザンの形成は、インキュベーションの0.5時間後に開始されますが、最適な結果を得るためには、少なくとも3時間22 MTTに細胞を曝露することをお勧めします。その結果、成長培地を除去し、DMSOでも26を使用することができるホルマザンは、有機溶媒、好ましくはイソプロパノール25に溶解する。媒体の除去は、増殖培地中に広く一般的であるフェノールレッド、以降正確な結果を達成し、そしてタンパク質は25吸光度測定に干渉する可能性が沈殿のために重要である。ときはフォーマ恐山溶液が均質に達すると、溶液の吸光度をマイクロプレートリーダー分光光度計を用いて測定される。 550nmでの吸光度は、ウェルあたりの細胞200-50,000の範囲で細胞数に直接比例し、したがって、細胞の非常に少量の22を検出することができる。吸光度は、薬物による治療後に残った生存細胞の量を示し、薬物に曝露されなかった対照細胞の吸光度と比較される。適切なソフトウェアによる結果の分析は、IC 50（阻害濃度を、50％）を提供した値と測定のいくつかの繰り返しに基づいて統計誤差。
MTTアッセイはその正確性や比較的単純による新しい抗がん化合物をスクリーニングするための細胞毒性研究で広く一般的です。酵素反応に依存しているMTTアッセイを用いて、ただし、1は、様々な酵素阻害剤は、AN MTTの還元に影響を与えることができることを考慮しなければならない誤った結果27につながるdは。また、MTTアッセイは、薬物2の細胞傷害活性の分子メカニズムのあらゆる情報を提供しない。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿に記載された方法は、生物学的細胞生存率アッセイによる化学合成を組み合わせる。生存細胞に関する任意の生物学的方法と同様に、層流フード内で作業し、滅菌有機溶媒の使用を含む無菌状態を維持することが重要である。また、加水分解に不安定な金属系薬物の製造及び貯蔵は、グローブボックス又はシュレンクライン技術が利用されるべき、不活性条件下で行われるべきである。 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
資金は、欧州共同体のセブンス枠組み計画（FP7/2007-2013）/ ERCグラント契約がない[239603]の下で、欧州研究評議会から受け取った
Materials
| Reagent/Material | |||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Hexane AR | Gadot | 830122313 | Dried using a solvent drying system |
| HT-29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| Isopropanol AR | Gadot | 830111370 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M5655-1G | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | Biological Industries | 03-031-1B | |
| RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| RPMI without phenol red | Biological Industries | 01-103-1A | |
| Tetrahydrofuran (THF) AR | Gadot | 830156391 | dried using a solvent drying system |
| Ti(OiPr)4 | Sigma-Aldrich | 205273-500ML | moisture sensitive |
| Trypsin/EDTA | Biological Industries | 03-052-1B | |
| VO(OiPr)3 | Sigma-Aldrich | 404926-10G | moisture sensitive |
| Equipment | |||
| 12-channel pipette 30-300 μl | Thermo Scientific | ||
| 12-channel pipette 5-50 μl | Finnpipette | ||
| 75 cm2 flask | NUNC | 156472 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | NUNC | 167008 | |
| CO2 Incubator | Binder | APT.line C150 | |
| Counter chamber | Marienfeld-Superior | 650030 | |
| Eppendorf vial | KARTELL | ||
| Glove box | M. Braun | ||
| Laminar flow hood | ADS LAMINAIRE | OPTIMALE 12 | |
| Microplate reader spectrophotometer | Bio-Tek | El-800 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Pipette 20-200 μl | Finnpipette | ||
| Pipette 5-50 μl | Finnpipette |
References
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