마이크로 RNA<em> 현장에서</em> 포르말린 고정 신장 조직에 대한 하이브리드
Summary
이 문서는 포르말린 고정 신장 섹션의 마이크로 RNA 발현 colormetric 검출에 최적화의 현장 하이브리드 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
이 문서에서 우리는 마이크로 RNA 프로브를 태그 제닌과 현장 하이브리드 화에를 통해 신장의 miRNA의 비색 검출하는 방법을 설명합니다. 원래 Kloosterman 및 Exiqon miRNA의 프로브 1 폭 넓은 사용을 위해 동료에 의해 개발 된이 프로토콜은, 신장 조직에서의 miRNA 분석에 내재 된 문제를 극복하도록 수정되었습니다. 여기에는 구조 식별 및 잔류 조사 및 항체를 제거하기 어려운 문제가 있습니다. 비교적 얇은 사용, 두께 5mm, 강한 프로브 신호가 세포 내에 유지하면서, 신장 구조의 명확한 시각화를 허용 조직 섹션. 또한, 프로브 농도와 배양 조건은 낮은 배경 및 비특이적 신호 마이크로 RNA 발현의 시각화를 용이하게하기 위해 최적화되었다. 여기서, 최적화 프로토콜은 프로 시저의 끝에서 슬라이드 실장 통해 초기 티슈 콜렉션 및 준비를 덮고, 설명한다. 기본 compone이 프로토콜의 국세청은 다른 조직과 세포 배양 모델 응용 프로그램에 대해 변경 될 수 있습니다.
Introduction
마이크로 RNA는 내생 적으로 생산되는 RNA를 비 암호화 (약 22 뉴클레오티드) 작은 수 있습니다. 그들은 일반적으로 번역 억압 또는 mRNA의 분해를 통해 단백질 발현을 억제하는 기능을한다. 완전 보완와 mRNA의 대상에있는 miRNA 바인딩, 그것이 가능한 하나의 miRNA가 여러 대상을 억제하기 위해 만드는.
세포의 종류와 구조의 miRNAs을 표현 이해 메커니즘을 이해의 중요한 부분 인을 통해 miRNA의 발현에 영향을 미치는 세포와 조직의 표현형의 변화. 이러한 miRNA의 시퀀싱, qPCR에 노던 블로 팅 등의 방법은 전체 조직에서의 miRNA의 검출에 사용 할 수 있지만,이 방법은 하나가 특정 조직 내에서 온 어떤 특정 세포 유형을 결정하는 것을 허용하지 않습니다. 이러한 방법을 사용하여 분석 전에 셀룰러 및 구조 구성 요소의 해부는 매우 어려울 수 있습니다 적절한 아이솔레이션을 달성하기 위해 필요한 조건은 알을 초래할 수 있습니다유전자 발현 또는 RNA를 저하에 terations. 원위치 혼성화에서 마이크로 RNA는 조직에서 마이크로 RNA 위치 및 발현 수준을 가시화하기 위해 사용하는 방법이다. 이 기술은 신장 등 이종 구조, 구성 조직에 특히 유용합니다.
마이크로 RNA는 신장 개발 2,3 생리학 4에서 규정하는 역할을하는 것으로 나타났다. 마이크로 RNA 발현의 변화는 또한 섬유증 5-10, 당뇨병 성 신증 7, 신장 암 11, 12, 급성 신장 손상은 13 신장 병리에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 우리의 연구에서는 신장 조직에 대한 현장 하이브리드 마이크로 RNA를 최적화하는 것이 건강과 질병 (14) 모두에 miRNA의 표현의 정확한 구조 위치를 결정하기위한 가치있는 것을 발견했다. 다른 마이크로 RNA의 관 및 세포 발현의 결정은 중요하기 때문에 타 자신의 규제rgets는 세포 기능에 의존 할 수있다. 병에 걸린 상태에서 그것은 miRNA의 발현의 변경 기능에 영향을 될 수있는 방법을 결정하는 것도 중요하다.
여기에 설명 된 방법의 목적은 Kloosterman 등. 15, 16, 17, 다른 연구자에 의해 개발 된 기존 ISH 방법론에 따라 구축 할 수 있었고, 사람들은 Exiqon 1에 의해 제안 된 포르말린 고정 신장 조직하는 방법을 최적화 할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 일방적 인 요관 폐색 (18)와 신장 마이크로 RNA 미르 – 382 식의 지역적인 차이를 식별하기 위해이 방법을 사용했습니다. 이러한 접근은 추가적인 최적화뿐만 아니라 다른 조직으로 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서의 목적은 포르말린 고정 신장 조직에서 잘 작동 현장 하이브리드 화에 miRNA를위한 프로토콜을 설명했다. 이 프로토콜을 작업하는 동안 염색 유물의 몇 가지 중요한 소스가 확인되었습니다. 이러한 점에주의는 염색 유물을 방지하고 성공적인 ISH 실행의 가능성을 높일 수 있습니다.
가 조직 섹션 긴 배양 중에 건조 할 때 염색 유물의 가장 예방 가능한 원인 중 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강의 미국 국립 연구소에 의해 지원되었다 HL082798 및 HL111580을 부여합니다.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| Fragments | |||
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
- Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
- Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors. J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).
- Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis. Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).
- Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1. Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).
- Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes. Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).
- Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).
- Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).
- Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β. Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).
- Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells. Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).
- Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers. Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).
- Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer. Urol. 75 (4), 835-841 (2010).
- Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21. Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).
- Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension. 122 (10), 439-447 (2012).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes. Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).
- Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).
- Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis. Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).
