MicroRNA<em> In situ</em> Hybridisatie voor formaline gefixeerde nierweefsel
Summary
Dit artikel beschrijft een in situ hybridisatie protocol geoptimaliseerd voor colorimetrische detectie van microRNA expressie in formaline gefixeerde niersecties.
Abstract
In dit artikel wordt een methode voor de colorimetrische detectie van miRNA in de nier beschrijven we door in situ hybridisatie met digoxigenine gelabeld microRNA probes. Dit protocol, oorspronkelijk ontwikkeld door Kloosterman en collega's voor een breed gebruik met Exiqon miRNA sondes 1, is aangepast om de uitdagingen die inherent zijn miRNA analyse in nierweefsel overwinnen. Deze omvatten zaken als identificatie structuur en moeilijk om de resterende sonde en antilichaam te verwijderen. Het gebruik van relatief dunne, 5 mm, weefselcoupes toegestaan duidelijke visualisatie van structuren nieren, terwijl een sterke testsignaal werd behouden in cellen. Bovendien werden probeconcentratie en incubatie-omstandigheden geoptimaliseerd om visualisatie van microRNA expressie met lage achtergrond en niet-specifieke signaal te vergemakkelijken. Hier wordt de geoptimaliseerde protocol beschreven voor een eerste weefsel en bereidingsmethodes door de montage van dia aan het einde van de procedure. De basis componegen van dit protocol kan worden aangepast voor toepassing op andere weefsels en celcultuur modellen.
Introduction
MicroRNA zijn klein (ongeveer 22 nucleotiden lang) niet-coderende RNA's die endogeen wordt geproduceerd. Zij over het algemeen functioneren van eiwit expressie te onderdrukken door middel van translationeel repressie of mRNA degradatie. miRNAs binden aan mRNA doelen met onvolledige complementariteit, waardoor het mogelijk is voor een enkele miRNA aan verschillende doelen te onderdrukken.
Begrijpen welke celtypen en structuren te uiten miRNA's is een belangrijk onderdeel van het begrijpen van de mechanismen waardoor veranderingen in miRNA expressie invloed cellen en weefsels fenotypes. Hoewel methoden zoals miRNA sequencing, qPCR en Northern blotting kan worden gebruikt voor de detectie van miRNAs geheel weefsels staat deze benadering niet mogelijk maken om te bepalen welke specifieke celtype ze uit in een gegeven weefsel. Dissectie van cellulaire en structurele componenten voorafgaand aan de analyse met behulp van deze methoden kan heel moeilijk zijn en het nodig is om een adequate isolatie bereiken omstandigheden kunnen leiden tot alterations in genexpressie of afbraak van RNA's. microRNA in situ hybridisatie is een methode die wordt gebruikt om microRNA locatie en expressie niveaus visualiseren in weefsels. Deze techniek is bijzonder waardevol in weefsels bestaande uit heterogene structuren, zoals de nieren.
MicroRNAs is aangetoond dat een regulerende rol in de ontwikkeling nier 2,3 en fysiologie 4 spelen. microRNA expressie veranderingen hebben ook aangetoond te worden betrokken met nier pathologie zoals fibrose 5-10, diabetische nefropathie 7, niercarcinoom 11,12, en acute nierschade 13. In ons onderzoek hebben wij gevonden dat het optimaliseren van microRNA in situ hybridisatie voor nierweefsel was waardevol voor het bepalen van de exacte locaties van structurele miRNA expressie in zowel gezondheid en ziekte 14. Bepaling van de buisvormige en cellulaire expressie van verschillende microRNAs is belangrijk omdat de regulering van targets kan afhankelijk cellulaire functies zijn. In zieke toestanden is het ook belangrijk om te bepalen hoe veranderingen in miRNA expressie kan beïnvloeden functie.
Het doel van de hier beschreven methode was om voort te bouwen op bestaande ISH methodieken ontwikkeld door Kloosterman et al.. 15, andere onderzoekers 16,17, en die voorgesteld door Exiqon 1 en optimaliseren van de methode voor het formaline gefixeerde nierweefsel. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze methode om duidelijke regionale verschillen in de renale microRNA miR-382 expressie met eenzijdige ureterobstructie 18 identificeren. Deze benadering kan worden gebruikt met andere weefsels ook, met extra optimalisatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van dit artikel was om een protocol voor miRNA in situ hybridisatie die goed werkt in formaline gefixeerde nierweefsel beschrijven. Tijdens het werken uit dit protocol een aantal belangrijke bronnen van kleuring artefact zijn geïdentificeerd. Zorgvuldige aandacht voor deze punten kan helpen voorkomen vlekken artefact en de kans op een succesvolle ISH run.
Een van de meest vermijdbare oorzaken van vlekken artefact kan optreden wanneer weefselsecties worden gedroogd tijdens …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de US National Institutes of Health verleent HL082798 en HL111580.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| Fragments | |||
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
- Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
- Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors. J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).
- Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis. Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).
- Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1. Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).
- Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes. Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).
- Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).
- Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).
- Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β. Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).
- Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells. Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).
- Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers. Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).
- Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer. Urol. 75 (4), 835-841 (2010).
- Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21. Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).
- Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension. 122 (10), 439-447 (2012).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes. Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).
- Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).
- Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis. Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).
