МикроРНК<em> В месте</em> Гибридизация на формалин ткани почки
Summary
В этой статье описывается в протокол гибридизация оптимизированный для колориметрического обнаружения микроРНК выражения в формалине секциях фиксированных в почках.
Abstract
В этой статье мы опишем метод колориметрического обнаружения микроРНК в почках через в гибридизация с дигоксигенином отмеченных микроРНК зондов. Этот протокол, первоначально разработанная Клостермана и коллег для обширного использования с Exiqon микроРНК зондов 1, был изменен, чтобы преодолеть проблемы, присущие анализа микроРНК в тканях почек. К ним относятся такие вопросы, как определение структуры и трудно удалить остаточный зонд и антитела. Использование относительно тонкий, толщиной 5 мм, срезы ткани позволили четкой визуализации структур почек, в то время как сильный сигнал зонда был сохранен в клетках. Кроме того, концентрация зонда и условия инкубации были оптимизированы для облегчения визуализации микроРНК выражения с низким фоном и неспецифической сигнала. Здесь, оптимизированный протокол описан, охватывающий первоначальный сбор тканей и подготовку через монтажа слайдов в конце процедуры. Основная ComponeNTS этого протокола могут быть изменены для применения в других тканях и моделей клеточных культур.
Introduction
МикроРНК небольшие (длиной около 22 нуклеотидов) некодирующих РНК, которые эндогенно производится. Как правило, они функционируют для подавления экспрессии белка через репрессии трансляции или деградации мРНК. микроРНК связываются с мРНК мишеней с неполной комплементарности, что делает возможным для одного микроРНК для подавления несколько целей.
Понимание того, какие типы и структуры клеток выразить микроРНК является важной частью понимания механизмов, через которые изменения в микроРНК выражение влияния клеток, тканей фенотипов. Хотя методы, такие как микроРНК последовательности, количественной ПЦР, Нозерн блоттинг может быть использован для обнаружения микроРНК в целом тканей, этот подход не позволяет определить, какой конкретный тип клеток они пришли в данной ткани. Рассечение клеточных и структурных компонентов до анализа с использованием этих методов может быть очень трудно и условия, необходимые для достижения адекватных обособления может привести к альterations в экспрессии или деградации РНК гена. микроРНК в гибридизация является метод, используемый для визуализации местоположения микроРНК и уровни экспрессии в тканях. Этот метод особенно ценен в тканях, состоящих из разнородных структур, таких как почки.
Микро РНК, как было показано играют регуляторную роль в 2,3 развития почек и физиологии 4. экспрессии микроРНК изменения, также было показано, участвуют с почечной патологией, таких как фиброз 5-10, диабетической нефропатии 7, почечной карциномы 11,12 и острой почечной 13. В нашем исследовании, мы обнаружили, что оптимизации микроРНК в гибридизация для тканей почек было ценным для определения точных структурных местоположения выражения микроРНК как в здоровье и болезни 14. Определение трубчатого и клеточной экспрессии различных микроРНК является важным, поскольку их регулирование таrgets может зависеть от клеточных функций. В пораженных государств важно также определить, как изменения в экспрессии микроРНК могут быть функции влияет.
Цель метода, описанного здесь в том, чтобы построить на существующих методологий ISH разработанных Клоостерман др.. 15, другие исследователи 16,17, а те, предложенный Exiqon 1 и оптимизировать метод формалином тканях фиксированных в почках. Мы успешно использовали этот метод для идентификации различных региональных различий в почечной выражения микроРНК микроРНК-382 с односторонним обструкции мочеточника 18. Этот подход может быть использован с другими тканями, а также с дополнительной оптимизации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Целью этой статьи было описать протокол для микроРНК в гибридизация, который хорошо работает в формалине тканей фиксированных в почках. При разработке этого протокола несколько важных источников окрашивания артефакта были определены. Пристальное внимание к этим вопросам может ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана американскими Национальными Институтами Здоровья предоставляет HL082798 и HL111580.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| Fragments | |||
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
- Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
- Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors. J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).
- Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis. Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).
- Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1. Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).
- Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes. Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).
- Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).
- Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).
- Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β. Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).
- Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells. Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).
- Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers. Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).
- Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer. Urol. 75 (4), 835-841 (2010).
- Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21. Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).
- Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension. 122 (10), 439-447 (2012).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes. Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).
- Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).
- Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis. Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).
