MicroRNA<em> In situ</em> Hybridation pour les tissus rénaux fixés au formol
Summary
Cet article décrit un protocole d'hybridation in situ optimisé pour la détection colorimétrique de l'expression de micro-ARN dans des sections de rein fixés au formol.
Abstract
Dans cet article, on décrit un procédé de détection colorimétrique de miARN dans le rein par hybridation in situ avec de la digoxigénine marqué dans les sondes de microARN. Ce protocole, développé à l'origine par Kloosterman et ses collègues pour une large utilisation de sondes Exiqon miRNA 1, a été modifié pour surmonter les difficultés inhérentes à l'analyse des miRNA dans les tissus rénaux. Il s'agit notamment des questions telles que l'identification de la structure et difficile à retirer la sonde résiduelle et anticorps. L'utilisation de relativement mince, 5 mm d'épaisseur, les coupes de tissus autorisés pour une visualisation claire des structures du rein, alors qu'un signal de la sonde solide a été maintenu dans les cellules. En outre, la concentration de la sonde et des conditions d'incubation ont été optimisés pour faciliter la visualisation de l'expression de microARN avec faible bruit de fond et le signal non spécifique. Ici, le protocole optimisé est décrit, couvrant la collecte de tissu initial et de la préparation à travers le montage de lames à la fin de la procédure. Le compone de basents de ce protocole peuvent être modifiés pour l'application à d'autres tissus et des modèles de culture cellulaire.
Introduction
MicroARN sont de petite taille (environ 22 nucléotides de long) non codantes des ARN qui sont produites de façon endogène. Ils fonctionnent généralement à supprimer l'expression de la protéine par la répression de translation ou la dégradation de l'ARNm. miARN se lient à des cibles ARNm avec complémentarité incomplète, ce qui permet à un seul miARN pour supprimer plusieurs cibles.
Comprendre les types et les structures cellulaires expriment miARN est une partie importante de la compréhension des mécanismes par lesquels des modifications dans miRNA influence d'expression cellulaire et des phénotypes de tissus. Bien que les méthodes telles que le séquençage miRNA, qPCR et Northern blot peuvent être utilisés pour la détection de miARN dans les tissus entiers, cette approche ne permet pas de déterminer quel type de cellule spécifique ils sont venus dans un tissu donné. Dissection de composants cellulaires et structurelles avant l'analyse à l'aide de ces méthodes peut être très difficile et les conditions nécessaires à la réalisation des isolations appropriées peut conduire à alterations dans l'expression génique ou de la dégradation d'ARN. microRNA hybridation in situ est une méthode utilisée pour visualiser l'emplacement de micro-ARN et des niveaux d'expression dans les tissus. Cette technique est particulièrement utile dans les tissus constitués de structures hétérogènes, tels que le rein.
Les microARN ont été montré à jouer un rôle de régulation dans 2,3 de développement du rein et de la physiologie 4. modifications d'expression de microARN ont également été montré pour être impliqué dans la pathologie rénale telles que la fibrose 5-10, la néphropathie diabétique 7, carcinome rénal 11,12, et l'insuffisance rénale aiguë 13. Dans notre recherche, nous avons constaté que l'optimisation de microARN hybridation in situ pour les tissus rénaux en était précieux pour déterminer les emplacements exacts structurelles d'expression des miARN dans la santé et la maladie 14. Détermination de l'expression tubulaire et cellulaire de différentes microARN est important parce que leur réglementation de targets peuvent dépendre de fonctions cellulaires. Dans les états pathologiques, il est également important de déterminer comment altérations de l'expression des miARN peuvent avoir des répercussions sur la fonction.
Le but de la méthode décrite ici était de construire des méthodologies ISH existants élaborés par Kloosterman et al. 15, d'autres enquêteurs 16,17, et ceux suggérés par Exiqon 1 et d'optimiser la méthode pour les tissus rénaux fixes au formol. Nous avons utilisé cette méthode avec succès pour identifier les différences régionales dans les microARN miR rénale expression-382 avec obstruction urétérale unilatérale 18. Cette approche peut être utilisée avec d'autres tissus, avec une optimisation supplémentaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le but de cet article est de décrire un protocole de miARN hybridation in situ qui fonctionne bien dans les tissus rénaux fixés au formol. Tout en travaillant sur ce protocole plusieurs sources importantes d'artefact coloration ont été identifiés. Une attention particulière à ces points peut aider à éviter la coloration artefact et augmenter la probabilité d'une course de ISH succès.
Une des causes les plus évitables de artefact coloration peut se produire lorsq…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les US National Institutes of Health accorde HL082798 et HL111580.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| Fragments | |||
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
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