Etkileşimi incelenmesi<em> Staphylococcus aureus</em> Akım Sitometri ve Time Lapse Mikroskopi tarafından Nötrofiller ile
Summary
Biz tarafından salgılanan PSM ve diğer toksinlerin etkisini araştırmak için yöntemler mevcut<em> Staphylococcus aureus</em> Akım sitometri ve floresan mikroskobu kullanarak nötrofiller üzerinde.
Abstract
Biz nötrofiller üzerinde Staphylococcus aureus tarafından üretilen ve salgılanan fenol çözünür modulins (PSM) ve diğer toksinlerin etkisini araştırmak için yöntemler sunuyoruz. Biz yoğunluk gradiyenti santrifüj kullanılarak taze nötrofil izole nötrofiller üzerindeki PSM etkilerini incelemek. Bu nötrofil kalsiyum mobilizasyon üzerine fluoresces bir boya ile yüklenir. PSM tarafından nötrofil aktivasyonu serbest hücre içi kalsiyum konsantrasyonu hızlı ve geçici bir artış başlatır. Bir akış sitometrisi deneyde bu hızlı harekete serbest Ca2 + konsantrasyonunun artmasına tepki ön-yüklemeli bir boya floresan izlenmesi ile ölçülebilir. Bu yöntemi kullanarak, biz nötrofil aktive ve nötrofil aktivasyonu özel ve genel inhibitörlerinin etkilerini ölçmek için gerekli konsantrasyonu belirlemek PSM olabilir.
Hücre içi alanı w PSM ifadesi araştırmake GFP için PSMα operonunun organizatörü muhabiri füzyon inşa ettik. Ne S. bu raportör suşları aureus nötrofiller tarafından fagosite edilir, ifade indüksiyon floresan mikroskobu kullanarak gözlemlenebilir.
Introduction
Nötrofiller (PMN) Staphylococcus aureus 1 karşı doğuştan gelen bağışıklık yanıtı önemli bir rol oynamaktadır profesyonel fagositlerdir. Ev sahibi ve mikrop arasındaki sürekli bir savaş hem de bir silahlanma yarışı yol açmıştır. Metisilin dirençli S. son zamanlarda, toplum ile ilişkili (CA) suşları aureus (MRSA) nötrofil öldürme 2,3 tuzağa çok etkili gibi görünüyor ortaya çıkmıştır. CA-MRSA aşırı fenol çözünür modulin (PSM) üretimi 4,5 daha yüksek virulans ile ilişkilendirilmiştir. İnsan nötrofilleri reseptör 6 birleştiğinde Bu G-proteini ile aktive yol FPR2 ile bu PSM tanıyabilir. Ilk olaylardan biri kalsiyum hücre içi mağaza (Ca 2 +) harekete geçirilmesidir. Ca 2 + degranülasyonunun ve fagositoz 7 de dahil olmak üzere PMNs'nin efektör çeşitli fonksiyonları için ikincil haberci olarak görev yapar. Bu nedenle Ca 2 + çok hassas bir göstergesidirPMN etkinleştirmek için PSM fonksiyonel kapasitesi. Nötrofiller üzerinde PSM etkilerini incelemek için, taze nötrofil kalsiyum mobilizasyonu üzerine fluoresces bir boya ile izole ve yüklenir. Bir akış sitometrisi deneyde bu hızlı harekete ölçülebilir. Bu yöntemi kullanarak, bu nötrofiller üzerindeki toksik ve diğer bileşenlerin doğrudan etkilerini incelemek ve bu aktif olan en düşük konsantrasyonunu belirlemek mümkündür. Bizim için, bu S. tarafından üretilen birçok proteinlerin etkisini araştırmak için çok yararlı bir araçtır aureus gibi FPR2 inhibitör protein (FLIPR) 8, 7 FLIPR benzeri, ve Staphylococcus aureus (CİPS) 9 Kemotaksis inhibitör protein gibi bağışıklık kaçırma, dahil. Tüm bu proteinler agonisti tanıma reseptöre bağlanarak nötrofillerde kalsiyum mobilizasyon inhibe ettiği gösterilmiştir.
Son zamanlarda, bizim grup PSM işlevsel 10 serum lipoproteinlerin tarafından inhibe olduğunu nitelendirdi </> Sup. Bu lipoproteinler PSM öncelikle hücre içi ortamda görevi yerine belirten, kan ve insan dokusu içinde bol miktarda mevcut bulunmaktadır. Kalsiyum mobilizasyon tahlilin durumu ki bu da serum çok düşük konsantrasyonları ile de inhibe ettiği gösterilen PSM tarafından nötrofil aktivasyonu, serum lipoproteinler etkisini ölçmek için izin verdi.
PSM işlevsel serum tarafından inhibe bu yana, hücre içi toksinler gibi PSM için önemli bir işlevi olduğunu varsaydık. Bu nedenle fagositoz sonra PSM rolünü belirlemeyi amaçladık. Arası boşlukta PSM ifadesi araştırmak için, GFP psmα operon promotörünün raportör füzyonlarının inşa ettiler. Ne S. bu raportör suşları aureus nötrofiller tarafından fagosite edildi, ifade indüksiyon floresan mikroskobu 10 kullanılarak gözlemlenebilir oldu. Açıkçası, bu technique S. genin çok sayıda ifade çalışma sağlar fagositoz sonra aureus veya diğer patojenleri. S. beri arası niş hayatta aureus bu niş aktif genlerin rolü okuyan, doğuştan gelen bağışıklık sistemi 11 10 12 üstesinden gelmek için çok önemlidir onun virülans anlamak için büyük önem taşımaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan yöntemler bazı adımlar çok önemlidir. Biz burada bu vurgular.
Yoğunluk dereceli santrifüj yoluyla nötrofil yalıtımı için santrifüj adımları sırasında ya da sonrasında katmanların rahatsız etmemek için önemlidir. Plastik bir pipet kullanarak nötrofil aspire zaman, hücre tabakasında ise, gibi çıkartma sıvı katmanları rahatsız edecek balon sıkmak için değil emin olun. Ayrıca görsel, ozmotik şok ve santrifüj aşamasından sonra topak, nöt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Fluo-3, AM | Molecular Probes / Life Technologies | F-1241 | |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | density 1.077 g/ml |
| Histopaque | Sigma | 11191 | density 1.119 g/ml |
| RPMI 1640 | Gibco, Life Technologies | 52400-025 | contains 25 mM HEPES and L-glutamine |
| Leica TCS SP5 microscope | Leica Microsystems, The Netherlands | TCS SP5 | objective: HCX PL APO 40X/0.85 |
| FACSCalibur | BD Biosciences | FACSCalibur | Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process |
References
- Rigby, K. M., DeLeo, F. R. Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections. Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).
- Voyich, J. M., et al. Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils. The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).
- Kobayashi, S. D., et al. Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus. J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).
- DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus. The Lancet. 375, 1557 (2010).
- David, M. Z., Daum, R. S. Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic. Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).
- Kretschmer, D., et al. Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus. Cell Host & Microbe. 7, 463 (2010).
- Prat, C., et al. A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR. J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).
- Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1. The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).
- de Haas, C. J., et al. Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent. The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).
- Surewaard, B. G. J., et al. Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles. PLoS Pathog. 8, e1002606 (2012).
- Kubica, M., et al. A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages. PLoS ONE. 3, e1409 (2008).
- Surewaard, B. G. J., et al. Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis. Cellular Microbiology. , (2013).
- Queck, S. Y., et al. RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus. Molecular Cell. 32, 150 (2008).
- Baban, C. K., et al. Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo. J. Vis. Exp. (69), e4318 (2012).
