Lo studio delle interazioni di<em> Staphylococcus aureus</em> Con neutrofili mediante citometria a flusso e Time Lapse Microscopy

Summary

Presenteremo i metodi per studiare l'effetto di PSMs e altre tossine secrete da<em> Staphylococcus aureus</em> Sui neutrofili mediante citometria a flusso e microscopia a fluorescenza.

Abstract

Vi presentiamo i metodi per studiare l'effetto di modulins solubili fenolo (PSM) e altre tossine prodotte e secrete da Staphylococcus aureus sui neutrofili. Per studiare gli effetti delle PSMs sui neutrofili isoliamo neutrofili freschi utilizzando densità centrifugazione in gradiente. Questi neutrofili sono caricati con un colorante fluorescente che su di mobilizzazione del calcio. L'attivazione dei neutrofili da PSMs avvia un aumento rapido e transitorio nella concentrazione di calcio intracellulare libero. In un esperimento di citometria a flusso questa rapida mobilitazione può essere misurata monitorando la fluorescenza di un colorante pre-caricato che reagisce alla maggiore concentrazione del Ca ^{2 +.} Usando questo metodo è possibile determinare la concentrazione di PSM necessario attivare la neutrofili, e misurare gli effetti degli inibitori specifici e generali di attivazione dei neutrofili.

Per studiare l'espressione dei PSMs nello spazio intracellulare, we hanno costruito fusioni giornalista del promotore dell'operone PSMα di GFP. Quando questi ceppi reporter di S. aureus sono fagocitati dai neutrofili, l'induzione di espressione può essere osservato mediante microscopia a fluorescenza.

Introduction

Neutrofili (PMN) sono fagociti professionali che svolgono un ruolo chiave nella risposta immunitaria innata contro Staphylococcus aureus ^1. La costante battaglia tra ospite e microbo ha portato a una corsa agli armamenti di entrambi. Recentemente, comunità-associati (CA) ceppi meticillino resistente S. aureus (MRSA) sono emerse, che sembra essere molto efficiente in elusione delle neutrofili uccisione ^2,3. Fenolo solubile modulin (PSM), eccessiva produzione di CA-MRSA è stato associato con una maggiore virulenza ^4,5. Neutrofili umani possono riconoscere questi PSMs via FPR2 che portano all'attivazione di tale G-proteina recettore accoppiato ^6. Uno dei primi eventi è la mobilitazione dei depositi intracellulari di calcio (Ca ^{2 +).} Ca ^{2 +} agisce come un messaggero secondario per una varietà di funzioni effettrici dei PMN compreso degranulazione e fagocitosi ^7. Pertanto Ca ^{2 +} è un indicatore molto sensibile dellacapacità funzionale del PSM per attivare PMN. Per studiare gli effetti di PSM su neutrofili, neutrofili freschi sono isolati e caricati con un colorante che reagisce su di mobilizzazione del calcio. In un esperimento di citometria a flusso questa rapida mobilitazione può essere misurata. Usando questo metodo, è possibile studiare gli effetti diretti di componenti tossici e di altro neutrofili, e determinare la concentrazione minima a cui essi sono attivi. Per noi, si tratta di uno strumento molto utile per studiare l'effetto di molte proteine ​​prodotte da S. aureus coinvolta in evasione immune, quali FPR2 proteina inibitoria (FLIPR) ^8, FLIPR-come ^7, e chemiotassi proteina inibitoria di Staphylococcus aureus (chips) ^9. Tutte queste proteine ​​hanno dimostrato di inibire la mobilizzazione del calcio in neutrofili legandosi al recettore che riconosce l'agonista.

Recentemente, il nostro gruppo ha descritto che PSM sono funzionalmente inibiti dalle lipoproteine ​​sieriche ^{10 <}/ Sup>. Queste lipoproteine ​​sono abbondantemente presenti nel sangue e tessuti umani, indicando che PSMs esercitano la loro funzione principalmente nell'ambiente intracellulare. La disponibilità del saggio mobilizzazione del calcio permesso di misurare con precisione l'effetto di lipoproteine ​​sieriche sull'attivazione dei neutrofili dai PSMs, indicata dalla notevole inibizione da concentrazioni molto basse di siero.

Poiché le PSMs sono funzionalmente inibiti dal siero, abbiamo ipotizzato che ci sia una funzione importante per PSMs come tossine intracellulari. Abbiamo quindi cercato di determinare il ruolo di PSM dopo la fagocitosi. Per studiare l'espressione dei PSMs nello spazio intercellulare, abbiamo costruito fusioni giornalista del promotore dell'operone psmα di GFP. Quando questi ceppi reporter di S. aureus sono stati fagocitati dai neutrofili, l'induzione dell'espressione era osservabile mediante microscopia a fluorescenza ^10. Ovviamente, questa technique consente di studiare l'espressione di un gran numero di geni in S. aureus o altri patogeni dopo fagocitosi. Poiché per S. aureus sopravvivendo nella nicchia intercellulare è molto importante per superare il sistema immune innato ^{11 10 12,} studiando il ruolo dei geni attivati ​​in questa nicchia è molto importante per comprendere la sua virulenza.

Protocol

1. Isolamento dei PMN dal sangue umano da densità centrifugazione Disegnare 5 9 ml provette di sangue venoso eparina. Preparare doppio strato gradienti Ficoll (4 gradienti per 5 provette sangue) come segue: Versare 12 ml di una densità di 1.119 g / ml soluzione Ficoll in un tubo da 50 ml e strato accuratamente 10 ml di una densità di 1,077 g / ml soluzione Ficoll in cima. Diluire il sangue con un volume uguale di PBS. Strato il sangue diluito con cura sullo strato doppio gradi…

Representative Results

Flusso saggio citometria per la valutazione di mobilizzazione del calcio in PMN umani Incubando neutrofili con una serie di concentrazione PSMα3 sintetici conseguente attivazione rapida come misurato da flusso di calcio, che è indicata da un aumento nel segnale in FL-1. Pre-incubazione di sintetico PSMα3 con 0,01%, siero umano 0,1% o 1% inibito significativamente la capacità di suscitare flussi di calcio (Figura 1). Analisi di espressione GFP nei b…

Discussion

Nei metodi descritti qui alcuni passaggi sono molto critico. Ci metterà in evidenza questi qui.

Per l'isolamento dei neutrofili centrifugazione in gradiente di densità è importante non disturbare gli strati durante o dopo le fasi di centrifugazione. Quando aspirazione dei neutrofili utilizzando una pipetta di plastica, fare attenzione a non schiacciare il pallone, mentre nello strato di cellule, come liquido di espulsione disturberà gli strati. Inoltre, controllare visivamente il pel…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fluo-3, AM	Molecular Probes / Life Technologies	F-1241
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	density 1.077 g/ml
Histopaque	Sigma	11191	density 1.119 g/ml
RPMI 1640	Gibco, Life Technologies	52400-025	contains 25 mM HEPES and L-glutamine
Leica TCS SP5 microscope	Leica Microsystems, The Netherlands	TCS SP5	objective: HCX PL APO 40X/0.85
FACSCalibur	BD Biosciences	FACSCalibur	Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process