Studera Interaktioner av<em> Staphylococcus aureus</em> Med Neutrofiler genom flödescytometri-och Time Lapse Mikroskopi

Summary

Vi presenterar metoder för att studera effekten av PSM och andra gifter som utsöndras av<em> Staphylococcus aureus</em> På neutrofiler med hjälp av flödescytometri och fluorescensmikroskopi.

Abstract

Vi presenterar metoder för för att studera effekten av fenol lösliga modulins (PSM) och andra gifter som produceras och utsöndras av Staphylococcus aureus på neutrofiler. För att studera effekterna av de PSM om neutrofiler vi isolerar färska neutrofiler som använder centrifugering density gradient. Dessa neutrofiler är laddade med ett färgämne som fluorescerar upon calcium mobilisering. Den aktiveringen av neutrofiler genom PSM initierar en snabb och övergående ökning av den fria intracellulära kalcium koncentration. I ett flödescytometri experiment denna snabb mobilisering kan mätas genom övervakning av fluorescensen av en förladdad färgämne som reagerar på den ökade koncentrationen av fri Ca ^{2 +.} Använda denna metod vi kan bestämma den PSM koncentration som är nödvändig för att aktivera neutrofila, och mäta effekterna av specifika och allmänna inhibitorer av den neutrofil aktiveringen.

För att undersöka uttrycket av de PSM i den intracellulära utrymmet, we har konstruerat reporter fusioner av den promotorn av den PSMα operonet till GFP. När dessa reporter stammar av S. aureus är fagocyteras genom neutrophils, kan den induktion av expression observeras användning av fluorescens mikroskopi.

Introduction

Neutrofiler (PMNs) är professionella fagocyter som spelar en nyckelroll i den innate immunsvar mot Staphylococcus aureus ^1. Den ständig kamp mellan värd och mikrob har lett till en kapprustning av båda. Som nyligen fått, community-associerade (CA) stammar av meticillin resistenta S. aureus (MRSA) har framkommit att verkar vara mycket effektiva i kringgående av neutrofil dödande ^2,3. Överdriven fenol lösligt modulin (PSM) produktion av CA-MRSA har associerats med högre virulens ^4,5. Humana neutrofiler kan känna igen dessa PSM via FPR2 som leder till aktivering av denna G-kopplad receptor för ^sex. En av de tidigaste händelserna är den mobilisering av intracellulära butiker av kalcium (Ca ^{2 +).} Ca ^{2 +} fungerar som en sekundär budbärare för en mängd olika effektorfunktionerna hos PMN: er inklusive degranulering och fagocytos ^syv. Därför Ca ^{två +} är en mycket känslig indikator på denfunktionell kapacitet av PSM för att aktivera PMN: er. För att studera effekterna av PSM på neutrofiler, är färska neutrofiler isoleras och laddad med ett färgämne som fluorescerar upon calcium mobilisering. I en flödescytometri experiment denna snabba mobilisering kan mätas. Använda denna metod, är det möjligt att studera de direkta effekterna av toxiska-och andra komponenter på neutrofiler, och bestämma den lägsta koncentration vid vilken dessa är aktiva. För oss, är det ett mycket användbart verktyg för att studera effekten av många proteiner producerade av S. aureus involverad i immun skatteflykt, såsom FPR2 inhiberande protein (FLIPR) ^8, FLIPR-liknande ^7, och Chemotaxis inhiberande protein av Staphylococcus aureus (CHIPS) ^9. Alla dessa proteiner har visat sig inhibera kalciummobilisering i neutrofiler genom att binda till receptorn erkänna agonisten.

Nyligen, har vår grupp beskriven att PSM funktionellt är inhiberas av serumlipoproteiner ^{10 <}/ Sup>. Dessa lipoproteiner är högst närvarande i blodet och mänsklig vävnad, vilket indikerar att PSM utövar sin funktion främst i den intracellulära miljön. Tillgängligheten av kalciummobiliseringen analysen tillät oss att exakt mäta effekten av serumlipoproteiner på aktivering av neutrofiler av PSM, indikeras av den betydande hämning av mycket låga koncentrationer av serum.

Eftersom PSM är funktionellt hämmas av serum, hypotes vi att det är en viktig funktion för PSM som intracellulära toxiner. Vi försökte därför att bestämma rollen av PSM efter fagocytos. För att undersöka uttrycket av PSM i det intercellulära utrymmet, har vi konstruerat reporter fusioner av promotorn för psmα operonet till GFP. När dessa reporter stammar av S. aureus var fagocyteras av neutrofiler, var induktion av expression observeras med fluorescens mikroskopi ^10. Uppenbarligen denna technique tillåter studiet av expression av ett stort antal gener i S. aureus eller andra patogener efter fagocytos. Eftersom för S. aureus överleva i intercellulära nisch är mycket viktigt att övervinna det medfödda immunförsvaret ^{11 10 12,} studera rollen av gener aktiveras i denna nisch är mycket relevant för att förstå dess virulens.

Protocol

Ett. Isolering av PMNs från humant blod genom densitetscentrifugering Rita 5 9 ml rör av hepariniserat venöst blod. Förbered dubbla lager Ficoll-gradienter (4 gradienter för fem tuber blod) enligt följande: Häll 12 ml av en densitet 1,119 g / ml ficoll lösning i ett 50 ml rör och försiktigt skiktet 10 ml av en densitet 1,077 g / ml ficoll lösningen på toppen. Späd blod med en lika stor volym PBS. Layer det utspädda blodet försiktigt på dubbla lager Ficoll gradient…

Representative Results

Flödescytometrisk analys för bedömning av kalciummobilisering i humana PMN Inkubation neutrofiler med en koncentration rad syntetiska PSMα3 resulterar i snabb aktivering mätt genom kalciumflöde, som visas genom en ökning i signalen i FL-1. Förinkubation av syntetiskt PSMα3 med 0,01%, inhiberad 0,1% eller 1% humant serum avsevärt förmågan att framkalla kalcium flussmedel (Figur 1). Analys av GFP uttryck i bakterier efter fagocytos av PMN med…

Discussion

I de metoder som beskrivs här några steg är mycket kritisk. Vi kommer att belysa dessa här.

För isolering av neutrofiler genom densitetsgradientcentrifugering är det viktigt att inte störa skikten under eller efter centrifugeringssteg. När aspirera neutrofiler med hjälp av en plast pipett, se till att inte pressa ballongen medan i lager av celler, kommer så mata vätska stör skikten. Också, visuellt inspektera pelleten av neutrofiler efter osmotisk chock och centrifugeringssteg. …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fluo-3, AM	Molecular Probes / Life Technologies	F-1241
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	density 1.077 g/ml
Histopaque	Sigma	11191	density 1.119 g/ml
RPMI 1640	Gibco, Life Technologies	52400-025	contains 25 mM HEPES and L-glutamine
Leica TCS SP5 microscope	Leica Microsystems, The Netherlands	TCS SP5	objective: HCX PL APO 40X/0.85
FACSCalibur	BD Biosciences	FACSCalibur	Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process