Summary

Ein Single-fly-Assay für Sammelverhalten in<em> Drosophila</em

Published: November 04, 2013
doi:

Summary

In diesem Video-Artikel beschreiben wir einen automatisierten Test, um die Wirkung von Hunger oder Sättigung auf olfaktorische abhängige Nahrungsmittel Suchverhalten in der Erwachsenen Obst messen Drosophila melanogaster.

Abstract

Für viele Tiere, Hunger fördert Veränderungen im olfaktorischen System in einer Weise, die die Suche nach geeigneten Nahrungsquellen erleichtert. In diesem Video-Artikel beschreiben wir einen automatisierten Test, um die Wirkung von Hunger oder Sättigung auf olfaktorische abhängige Nahrungsmittel Suchverhalten in der Erwachsenen Obst messen Drosophila melanogaster. In einem lichtdichten Gehäuse mit rotem Licht, die unsichtbar für Fruchtfliegen ist beleuchtet, eine Kamera, um benutzerdefinierte Datenerfassungssoftware verknüpft überwacht die Position von sechs Fliegen gleichzeitig. Jede Fliege beschränkt sich auf in einzelnen Arenen, die eine Nahrungsmittelgeruch in der Mitte gehen. Die Testarenen ruhen auf einem porösen Boden, die Funktionen, um Geruch Ansammlung zu verhindern. Latenz, um die Geruchsquelle, eine Metrik, Geruchsempfindlichkeit unter verschiedenen physiologischen Zuständen spiegelt zu finden, wird von der Software-Analyse bestimmt. Hier diskutieren wir die kritische Mechanik der Ausführung dieses Verhaltens-Paradigma und decken spezifische Fragen der Fliege loading, Geruchsbelastung, Temperatur-Test, Datenqualität und statistische Analyse.

Introduction

Staaten von Hunger fördern zwei Arten von appetitive Verhalten: Nahrungssuche und der Nahrungsaufnahme ein. Diese einfache Verhaltenstest ist nützlich für die Untersuchung der chemotaktischen Verhalten mit Futter 2,3 verbunden. Insbesondere verfolgt sie fly Position, Laufgeschwindigkeit und Latenz auf der Suche nach einem Lebensmittelgeruch Ziel. Latenz von Lebensmitteln Stellung dient als Maß für die Messung von Veränderungen in der Empfindlichkeit des Fliegengeruchserkennungssystem stromabwärts von Änderungen im internen Zustand appetitive. Eine manuelle Version dieses Tests wurde zuvor verwendet, um zu zeigen GABA-B-Rezeptor-Signal ist für die Geruchslokalisierung Verhalten wichtig in der Erwachsenen 3 fliegt. Die aktuelle Version des automatisierten Test war maßgeblich an der Studie, wie kurz Neuropeptid-F (sNPF) Signalisierung formt die olfaktorischen Karte in Drosophila und Einflüsse appetitive Verhaltensweisen 2.

Tests in einem dunklen, Temperatur und Feuchtigkeit kontrollierten Raum erfolgen. DigitalVideokameras über den klaren Acryl-Testplatten gesetzt verfolgen Fliegen durch 660-nm-LED-Beleuchtung hinterleuchtet. Informationen von der Kamera in Echtzeit von einem Computer stationiert neben dem Testbereich verarbeitet. Wir verwenden Datenerfassungssoftware, die während der Testphase und speichert die Koordinaten der Flugpositionen.

In diesem Paradigma wird das Thema in einer Arena, die eine Nahrungsmittelgeruch in der Mitte enthält freigesetzt; der Geruch Objekt schafft eine Nahrungsmittelgeruch Gradienten in der Arena, die Nahrungssuche in der Flugverhalten auslöst. Ein ähnlicher Geruch Suche Protokoll zu der Studie der Chemosensorik in einzelnen Drosophila-Larven 7 angewandt. Während andere Verhaltenstests, wie der Vier-Felder-Olfaktometer 4,5 oder dem T-Labyrinth 6 bewerten Geruchsaversion oder Anziehung Verhalten, wird dieses Paradigma besten geeignet, um Geruchsempfindlichkeit und Chemotaxis Verhalten zu beurteilen.

Mehrere wichtige Vorteile begleiten diese assay. Erstens ermöglicht sie schnelle Erfassung großer Datenmengen, da die Datenerhebung und-analyse sind meist automatisiert. Zweitens trennt dieser Test und misst das Verhalten von Einzellinie, wodurch soziale olfaktorische Signale, die ihr Verhalten beeinflussen können. Drittens, die Einfachheit des Protokolls und einfachen experimentellen Design machen den Test effizient und einfach, andere zu lehren.

Zusätzlich kann dieser Test verwendet werden, um weitere Sonde neuronalen Schaltkreise durch die Kombination mit der umfangreichen genetischen Toolkit zur Verfügung, um Drosophila melanogaster 8 zugrunde liegenden Nahrungssuchverhalten werden. Gezielte Expression von Transgenen, dass Schweigen zu erregen oder Neuronen können mit Tools wie der GAL4-UAS-System sowie der FH-shibire ts1, UAS-Tetanus-Toxin und UAS-TRPA1 (B) erreicht werden Transgene 12.09.

Protocol

1. Fly-Sammlung und Hunger Rück die Versuchsfliegen unter kontrollierten Temperatur-und Feuchtigkeitsbedingungen (zB 21 ° C, 50-60% relative Luftfeuchtigkeit) auf einem 12-Stunden Licht / Dunkel-Zyklus. Sammeln weiblichen fliegt am Tag des Schlüpfens und sie, zusammen mit 4-5 Männchen, in neue Lebensmittelflaschen (maximal 30 pro Fläschchen). Alter fliegt 2-5 Tage. Bereiten Sie die Kammern für Fliegen Hunger. Drücken Sie eine einzelne Gewebe (4,8 x 8,4 Zoll) bis au…

Representative Results

Die Datenanalyse-Software und die Anordnung, von der ein Beispiel in Fig. 1 zu sehen ist, werden nach einer Reihe von Analysekriterien verwendet, um die Leistung der einzelnen Fliegen während der 10 Minuten Versuchs auszuwerten. Die folgenden Kriterien werden verwendet, um festzustellen, ob Daten von jeder Fliege wird für die Datenanalyse verwendet werden und sind entworfen, um jene Fliegen, die nicht in der Lage, die Nahrung Suchaufgabe aufgrund einer Verletzung, Krankheit, Stress oder mangelnde Moti…

Discussion

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Lebensmittel-Suchverhalten Assay. Zusätzlich zu Lebensmitteln Gerüche, können aber auch für die Untersuchung des Fliegen Fähigkeit, andere Objekte zu lokalisieren Geruch angepasst werden. Zum Beispiel kann es zu der Studie von Mate-Lokalisierung Verhalten in männlichen Fliegen 3 angewendet werden Es gibt einige zusätzliche Überlegungen für dieses Protokoll, das wir zu diesem Verfahren hier zu erwähnen.:

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien JWW aus dem National Institute of Health (R01DK092640) und der National Science Foundation (0920668) unterstützt.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Apple Cider Vinegar Spectrum commercially available
Agarose, Type VII Sigma-Aldrich A0701 low gelling temperature agarose
Acrylic Testing Plate custom Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements.
LabVIEW V.8.5 National Instruments 776670-09 platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking–Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking–Six zones.vi" to run.
LabVIEW Vision 8.5
LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5
LabVIEW Vision Builder AI 3.5
Igor Pro V.6 Wavemetric, Inc. platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking–Six Zones
Basler scA1390-17fm National Instruments 779980-01 Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com
8 mm lens National Instruments 780024-01 Lens for Basler Digital Camera
Ground Glass Diffuser Plate Edmund Optics custom Diffuses light, 25 cm x 30 cm
US Std. No. 100 Fischer Scientific 04-881X Sieve with nominal opening of 150 μm
Lighting Option 1
LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm) Spectra West BL47192 a simpler but more expensive lighting option.
Power Supply for LED Backlight Spectra West
Lighting Option 2
660 nm LEDs Superbrightleds RL5R1330 Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel)
Linear DC Power Supply GW Instek GPS-1830D Power supply for LED Panel
Solderless Breadboard Digikey 922354-ND Breadboard for LEDs

References

  1. Dethier, V. G. . The hungry fly : a physiological study of the behavior associated with feeding. , (1976).
  2. Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145, 133-144 (2011).
  3. Root, C. M., et al. A presynaptic gain control mechanism fine-tunes olfactory behavior. Neuron. 59, 311-321 (2008).
  4. Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
  5. Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J. Exp. Biol. 209, 2739-2748 (2006).
  6. Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 708-712 (1974).
  7. Fishilevich, E., Domingos, A. I., Asahina, K., Naef, F., Vosshall, L. B., Louis, M. Chemotaxis behavior mediated by single larval olfactory neurons in Drosophila. Curr. Biol. 15, 2086-2096 (2005).
  8. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  9. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
  10. Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).
  11. Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O’Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
  12. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).

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Cite This Article
Zaninovich, O. A., Kim, S. M., Root, C. R., Green, D. S., Ko, K. I., Wang, J. W. A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila. J. Vis. Exp. (81), e50801, doi:10.3791/50801 (2013).

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