وcoculture عضوي النمط شريحة الدماغ مع خلايا سرطان تمكن تصور التغيرات المورفولوجية التي كتبها مضان وكذلك حقل مشرق (فيديو) المجهري خلال عملية غزو الخلايا السرطانية للأنسجة المخ. هذا النظام يسمح أيضا نموذج لنهج الصرف الخلايا وتجديد، ويقدم مجموعة واسعة من التلاعب والتحليلات.
المرضى الذين يعانون من ورم خبيث من سرطان المخ ان يكون الفقراء التشخيص. ومع ذلك، فقد تم التحقيق بالكاد عملية في موقع المنتشر، ولا سيما دور المقيمين (اللحمية) الخلايا. تثبت الدراسات الأولية في سرطان تأثير المكروية على ورم خبيث، وحتى على التكهن 1،2. خصوصا الورم المرتبطة الضامة (TAM) الهجرة الدعم، والغزو وانتشار 3. ومن المثير للاهتمام، والمواقع المستهدفة الرئيسية من ورم خبيث تمتلك الضامة الأنسجة محددة، مثل خلايا كوبفر في الكبد أو الخلايا الدبقية الصغيرة في الجهاز العصبي المركزي. وعلاوة على ذلك، فإن مواقع النقيلي تمتلك أيضا خلايا الأنسجة محددة أخرى، مثل الخلايا النجمية. مؤخرا، تم أثبتت الخلايا النجمية لتعزيز انتشار واستمرار الخلايا السرطانية 4،5. وبالتالي، وظائف من أنواع الخلايا الأنسجة محددة ويبدو أن هذه مهمة جدا في عملية الانبثاث الدماغ 6،7.
على الرغم من هذه الملاحظات،ومع ذلك، وحتى الآن ليس هناك مناسبة في الجسم الحي / في المختبر نموذج المتاحة لتصور ردود الفعل مباشرة الدبقية خلال تشكيل ورم خبيث في الدماغ، ولا سيما عن طريق المجهر مشرق الميدان. مؤخرا في الجسم الحي التصوير حية من خلايا سرطان أظهرت سلوكهم الاستعمار الدماغي 8. ومع ذلك، وهذه الطريقة شاقة جدا ومكلفة ومعقدة تقنيا. بالإضافة إلى ذلك، يتم تقييد هذه الأنواع من التجارب على الحيوانات لسلسلة صغيرة، وتأتي مع الإجهاد الكبير للحيوانات (عن طريق غرس لوحة الزجاج، وحقن من الخلايا السرطانية، والتخدير المتكررة والتثبيت على المدى الطويل). علاوة على ذلك، في الجسم الحي التصوير يقتصر حتى الآن على تصور من خلايا سرطان، في حين أن التفاعل مع الخلايا المقيمين لم يتم توضيح. أخيرا، والتحقيقات من خلايا سرطان الإنسان داخل الحيوانات مناعيا من المستحيل 8.
لهذه الأسباب، أنشأنا consi نظام cocultureاللدغة من شريحة عضوي النمط مخ الفأر والخلايا الظهارية جزءا لا يتجزأ من matrigel (3D خلية المجال). تم وضع خلية سرطان المجالات 3D مباشرة بجوار حافة شريحة الدماغ من أجل التحقيق في غزو أنسجة المخ المجاورة. وهذا يتيح لنا أن تصور التغيرات المورفولوجية والتفاعلات بين الخلايا الدبقية وسرطان الخلايا بواسطة مضان وحتى من قبل مشرق المجهري الميدان. بعد التجربة coculture، وأنسجة المخ أو الخلايا الكروية 3D يمكن جمعها واستخدامها لمزيد من التحليلات الجزيئية (مثل QRT-PCR، IHC، أو طخة مناعية) فضلا عن التحقيقات التي المجهري متحد البؤر. هذه الطريقة يمكن تطبيقها على رصد الأحداث داخل أنسجة المخ تعيش لأيام دون الآثار الضارة للشرائح الدماغ. نموذج يسمح أيضا قمع انتقائية واستبدال خلايا المقيمين من قبل الخلايا من الأنسجة المانحة لتحديد أثر متميزة من راثى معين. أخيرا، فإن النموذج coculture هو بديل عمليالفي الجسم الحي النهج عند اختبار المعالجات الدوائية المستهدفة.
أظهرت التحقيقات النسيجية السابقة من ورم خبيث في الدماغ تغيرات سريعة وجذرية من الخلايا الدبقية المقيمين، خاصة من الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة 13. لدراسة هذه التغيرات والتفاعلات مع خلايا سرطان، وهذا النظام coculture الرواية هي مناسبة تماما. المجالات البحثية الأخرى لديها بالفعل خبرة طويلة مع عضوي النمط شرائح الدماغ الحصين. ميزة واحدة هي أن عضوي النمط الثقافات شريحة الحصين الدماغ قابلة للبقاء والحفاظ على نحو فعال لعدة أيام إلى أسابيع، مما يجعلها مناسبة للتجارب طويلة الأجل. منذ بدء العمل ستوبيني للنظام عضوي النمط شريحة الحصين في عام 1991، وقد تم استخدامه على نطاق واسع، على سبيل المثال في مجال البحوث من الأمراض التنكسية. وبالتالي، فإن هذا النظام coculture الابتكار يمثل تعديل نهج راسخة مع مجموعة من التطبيقات في 9،11 البيولوجيا الورم. التعديل قدم لنا نموذجا استنساخه لتقييم درجة من غزو الورم بالعربيةهي مناسبة terwards والثقافات التي يزرعها أسلوب واجهة مثالي للتجارب التي تتطلب بنية ثلاثية الأبعاد. وقد استخدمت العديد من التقنيات لcoculture شرائح الحصين عضوي النمط مع الخلايا الأخرى. وتشمل هذه نظام غير المباشرة بين خلايا البلاعم وعضوي النمط شريحة الدماغ 14، وcoculture مباشرة من شريحتين مختلفة من منطقة الحصين 15. كما تم cocultured المجاميع دبقي مع شرائح الدماغ 16. هذه النماذج يمكن استخدامها لتحليل الأحداث الخلوية والجزيئية في شرائح الدماغ ولكن لا تسمح، الاتصال الفسيولوجية المباشرة بين الخلايا السرطانية، والخلايا الدبقية الصغيرة لحمة الدماغ. وعلاوة على ذلك، وهذا الأسلوب يسمح للمراقبة الخلايا الدبقية الصغيرة دون التسبب في تلوث العظام المستمدة من نخاع المحيطية وحيدات / الضامة. استخدام CCR2 وCX3CR1 نموذج الفأر وراثيا هو تحسين الحرجة يرجع ذلك إلى حقيقة أنه من الصعب التمييز بين الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمين من غزو حيداتاستنادا إلى خصائصها مماثلة 17،18،19. على الرغم من حقن داخل المخ من خلايا سرطان يسمح بالتحقيق تطور الورم، فإنه لا يمكن أن أقول الكثير حول ما إذا كانت الخلايا الشبيهة بلعم تحيط تنشأ من السكان المقيمين الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ أو من العظام المستمدة من نخاع المحيطية وحيدات / الضامة 17. قدم فريق من Kettenmann على عضوي النمط شريحة الدماغ نموذج التي تشارك بتلقيح الخلايا دبقي إلى شرائح الدماغ مع مياداة مجهرية 20. ومع ذلك، الاورام الدبقية الخبيثة الأولية تختلف في نواح كثيرة من سرطان النقيلي. الأولى، الاورام الدبقية الخبيثة هي من أصل الوسيطة، لا تنتشر خارج الجهاز العصبي، وتهاجر / غزو الخلايا واحد كما هو الحال مع أي الحدود بين الورم وأنسجة المخ. على النقيض من ذلك، فإن النمو الارتشاحي هو سمة مرضية نموذجية، ومثل هذه السرطانات عادة ما تهاجر / غزو كما الأفواج. الثاني، سرطان في كثير من الأحيان في محاولة لإعادة بناء هياكل الظهارية في الدماغ، في حين أن الخلايا الدبقيةمحاولة لفصل الورم من أنسجة المخ من قبل (الزائفة) كبسولة. النظر في السمات البيولوجية والمورفولوجية، دبقي الخبيثة وورم خبيث من سرطان لا يمكن مقارنتها حقا. لهذه الأسباب، فإننا تعديل وتطوير نظام coculture حيث أننا لا حقن ولكن coculture المكونات خلية سرطان المتاخمة للشريحة الدماغ. وعلاوة على ذلك، لاحظنا دبقية وتراكم نجمي على الحدود بين المكونات الورم، وهذا يعني أن الخلايا الدبقية الصغيرة إدخال القابس الورم ويمكن اكتشافها بسهولة بواسطة المجهر مشرق الميدان وأكد بعد ذلك بواسطة المجهر متحد البؤر. غزو الخلايا السرطانية في شريحة الدماغ، وهو مشابه إلى الوضع الحقيقي في الجسم الحي وإلى الملاحظة التي أبداها Baumert والزملاء، الذين وجدوا منطقة التسلل في 63٪ من الحالات تشريح الدماغ مع الانبثاث 21.
بسبب التروية الدموية في عداد المفقودين، لا يوجد سوى الضامة المقيم / الخلايا الدبقية الصغيرة في هذه الثقافة. علاوة على ذلك، بسبب مخلايا T آيسنج، وبالتالي تغيب ألو-تفاعل، يمكن أن تستخدم خلايا سرطان الإنسان لcoculture حتى مع شرائح الدماغ من الفئران او الجرذان مناعيا (NMRI، B6، أو ويستار). هذه يمكن أن تكون بمثابة بديل للنموذج الفأر عارية. منذ 4-5 شرائح يمكن الحصول عليها من كل فأر، يطلب من انخفاض كبير أعداد الحيوانات، بالمقارنة مع النماذج حقن القائمة. بالإضافة إلى ذلك، الحيوانات لا تعاني لفترة طويلة من المرض المنتشر، وأنها لا تخضع للإجراءات المنطوق متكررة 22.
مع هذا النظام coculture، لقد أثبتنا تفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة من قبل الخلايا السرطانية وتعزيز قدرة غزو الخلايا السرطانية. بالإضافة إلى ذلك، هذه هي المرة الأولى، على حد علمنا، تم العثور على الخلايا الدبقية الصغيرة لنقل بنشاط خلايا سرطان 23.
على الرغم من كل هذه المزايا، نظام coculture، في الواقع، وأيضا القيود. فإنه لا يزال في المختبرنموذج المفقودين الخطوات من ورم خبيث قبل الاستعمار. بسبب عدم وجود التروية، فإنه ليس من الممكن لدراسة التسرب. وبالتالي، فإن طريقة بديلة لدراسة التسرب هو استخدام إما في الجسم الحي نموذج الحقن أو نظام غرفة بويدن تعديل مع المصفوفة خارج الخلية، وHUVEC الخلايا النجمية لتقليد حاجز الدم في الدماغ 22،24. طريقة coculture شريحة الدماغ لا يزال نموذجا موثوق بها وقابلة للتكرار مع العديد من المزايا والمحتملة لمجموعة واسعة من التطبيقات، مثل تحليل الاستعمار، ولا سيما مع التركيز على دور الخلايا المقيمين. الجمع مع التقنيات الأخرى المنشأة (مثل المناعية، متحد البؤر المجهري والوقت الفاصل بين المجهري) يدعم التحقيق في الخلية مباشرة الى خلية التفاعلات. وهو بديل سهل وتكامل التقنيات الأخرى ويتيح الوصول إلى التحقيق في العظة والآثار، التي تفرضها المكروية النقيلي.
The authors have nothing to disclose.
المؤلفين أشكر Chalid غضبان لمساعدته فنية ممتازة، أندرياس Wodarz وستيفان Heermann للحصول على المشورة التقنية بشأن متحد البؤر والوقت الفاصل بين المجهري. ليس هناك تضارب مصالح لأي من المؤلفين. ويتم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث الألمانية (DFG) في المشروع 2 من Forschergruppe 942 (BI FOR942 703/3-1)، من فستان. باير شتيفتونغ (بادن Württembergischer Krebspreis، ألمانيا) وبرنامج البحوث التابع لكلية الطب، جورج أغسطس الجامعة غوتنغن، ألمانيا.
Material Name | Company | Catalogue number | Comment |
Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco, Darmstadt,Germany | 24020 | |
Minimum essential medium (MEM) | Gibco, Darmstadt , Germany | 32360 | |
RPMI-1640 | PAA Laboratories Inc., Cölbe, Germany | E15-840 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Pan Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 | |
Normal horse serum (NHS) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 16050-122 | |
Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10091148 | |
Glucose | B. Braum, Melsungen, Germany | ||
L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution | Sigma, Steinheim, Germany | G1146 | |
Vibratome | Leica, Wetzlar, Germany | Leica VT1200S | |
Microtome | Leica, Wetzlar, Germany | Leica SM 2000R | |
Polycarbonate membrane | BD Falcon, Heidelberg,Germany | 353090 | transwell membrane insert (0.4 μm pore size) |
ECM gel | Trevigen, R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany | 3432-005-01 | Basement membrane extract |
Metallic spacer | Kig GmbG, Kirkel, Germany | DIN 433 | |
Confocal microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | LSM 510 | |
Time-lapse microscope and camera | Leica, Wetzlar, Germany | DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera | |
Anatomy microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | Stemi SV11 | |
Paraformaldehyde | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04005.1000 | |
Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody | Sigma, Steinheim, Germany | G3893 | |
Goat anti-mouse IgG, F(ab')2– TRITC | Santa Cruz, Heidelberg, Germany | SC3796 | |
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 132450 | |
DAPI (4',6'-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride) | Sigma, Steinheim, Germany | D8417 | |
Fluorescent mounting medium | DAKO, Glostrup, Denmark | S3023 |