Den organotypic hjernen skive coculture med karcinomceller muliggjør visualisere morfologiske endringer ved fluorescens samt lyse felt (video) mikros under prosessen med carcinoma celle invasjon av hjernevev. Denne modellen systemet gir også mulighet for celle utveksling og påfyll tilnærminger, og tilbyr et bredt utvalg av manipulasjoner og analyser.
Pasienter med cerebral metastasering av Kreftsvulster har en dårlig prognose. Imidlertid har prosessen ved metastatisk nettstedet knapt blitt undersøkt, særlig rollen som bosatt (stromal) celler. Studier i primær karsinomer viser innflytelsen av mikromiljøet på metastasering, selv om prognose 1,2. Spesielt tumorassosierte makrofager (TAM) støtte migrasjon, invasjon og spredning tre. Interessant nok har de store målområder av metastase har vevs-spesifikke makrofager, som Kupffer-celler i leveren eller mikroglia i sentralnervesystemet. Videre er de metastaser besitter også andre vevs-spesifikke celler, slik som astrocytter. Nylig, astrocytter ble demonstrert for å fremme spredning og persistens av kreftceller 4,5. Derfor er funksjoner av disse vev-spesifikke celletyper synes å være meget viktig i prosessen med hjernemetastaser 6,7.
Til tross for disse observasjonene,Men til nå er det ikke egnet in vivo / in vitro-modell er tilgjengelig for direkte visual glial reaksjoner under cerebral metastasedannelsen, spesielt ved sterkt felt mikroskopi. Nyere in vivo direkte avbildning av karcinomceller vist sin cerebral kolonisering atferd åtte. Imidlertid er denne metoden meget arbeidskrevende, kostbart og teknisk komplisert. I tillegg er slike dyreforsøk begrenset til små serier, og er utstyrt med en betydelig stress for dyrene (ved implantering av glassplaten, injeksjon av tumorceller, repeterende anestesi og langvarig fiksering). Videre er in vivo avbildning hittil begrenset til visualiseringen av karcinomceller, mens interaksjoner med hørende celler ikke har blitt vist på figuren. Til slutt, undersøkelser av menneskelige karcinomceller innenfor immunkompetente dyr er umulig åtte.
For disse grunner, etablerte vi en coculture system consisvi av en organotypic mus hjernen skive og epitelceller innebygd i matrigel (3D celle sfære). 3D-karsinom celle sfærer ble plassert rett ved siden av hjernen skive kanten for å undersøke invasjonen av nabo hjernevev. Dette gjør oss i stand til å visualisere morfologiske endringer og interaksjoner mellom gliacellene og karcinomceller av fluorescens og selv med lyse felt mikroskopi. Etter coculture forsøket, kan i hjernevevet eller 3D-celle sfæroider samles og brukes for videre molekylære analyser (f.eks QRT-PCR, IHC, eller Immunoblotanalyse), så vel som for undersøkelser av konfokal mikroskopi. Denne metoden kan anvendes til å overvåke hendelser innen et levende hjernevev for dager uten skadelige effekter på hjernen skiver. Modellen gjør det også mulig selektiv undertrykkelse og utskifting av hørende celler av celler fra en donor-vev for å bestemme den distinkte virkningen av en bestemt genotype. Endelig er coculture modellen et praktisk alternativtil in vivo tilnærminger når testing målrettede farmakologiske manipulasjoner.
Tidligere histologiske undersøkelser av cerebral metastase demonstrert raske og drastiske endringer av de fastboende gliacellene, spesielt av astrocytter og microglia 13. Å studere disse endringene og interaksjoner med karcinomceller, er denne romanen coculture systemet velegnet. Andre forskningsfelt som allerede har lang erfaring med organotypic hippocampus hjernen skiver. En fordel er at de organotypic hippocampus hjernen skive kulturer er levedyktig og effektivt bevart i dager til uker, noe som gjør den egnet for langvarige forsøk. Siden Stoppini innføring av den organotypic hippocampal skive system i 1991, har det vært mye brukt, for eksempel i forskning av degenerative sykdommer. Dermed representerer dette innovere coculture systemet en modifikasjon av et veletablert tilnærming med en rekke applikasjoner i tumorbiologi 9,11. Modifikasjonen tilbød oss en reproduserbar modell for å vurdere karakteren av tumor invasjon afterwards og kulturer dyrket ved skjæringsmetoden er ideelt egnet for eksperimenter som krever en tre-dimensjonal struktur. Flere teknikker har blitt brukt til å coculture organotypic hippocampus skiver med andre celler. Disse omfatter et indirekte system mellom makrofager og organotypic hjernen skive 14, og en direkte coculture av to forskjellige stykker fra den hippocampal regionen 15.. Glioma aggregater har også blitt cocultured med hjernen skiver 16. Disse modellene kan brukes til å analysere cellulære og molekylære hendelser hjerneskiver, men tillater ikke direkte, fysiologisk kontakt mellom tumorceller, mikroglia og hjernen parenchyma. Videre gir denne metoden observasjon av microglia uten forurensning av benmarg-avledet perifere monocytter / makrofager. Bruken av CCR2 og CX3CR1 transgen musemodell er en kritisk forbedring på grunn av det faktum at det er vanskelig å skille beboeren microglia fra invaderende monocytterbasert på sine tilsvarende egenskaper 17,18,19. Selv intra injeksjon av karcinomceller tillater etterforsker tumor progresjon, kan det ikke fortelle mye om hvorvidt de omgitt makrofag-lignende celler stammer fra hjernen-resident mikroglia befolkning eller fra benmarg-avledet perifere monocytter / makrofager 17. Teamet av Kettenmann innført en organotypic hjernen skive modell som er involvert inoculating gliomceller i hjernen skiver med en micromanipulator 20. Men primære maligne gliomer skiller seg på mange hilsen fra metastatisk karsinom. Først, ondartet gliom er av mesenchymal opprinnelse, ikke metastasere utenfor nervesystemet, og migrere / invadere som enkle celler uten noen kant mellom tumor-og hjernevev. Som kontrast er infiltrerende vekst en typisk patologisk karakteristisk, og slike karsinomer vanligvis migrere / invadere som kohorter. For det andre karsinomer ofte forsøker å gjenoppbygge epiteliale strukturer i hjernen, samtidig som gliacellerforsøker å skille svulsten fra hjernevevet med et (pseudo) kapsel. Vurderer biologiske og morfologiske egenskaper, malignt gliom og metastasering av karsinomer er egentlig ikke sammenlignbare. For disse grunner, vi endret og utviklet en coculture system hvor vi ikke injisere men coculture en carcinoma cell plugg ved siden av hjernen skive. Videre observerte vi microglial og astrocytic opphopning på grensen av svulsten plugg, noe som betyr at microglia inn svulsten pluggen og kan lett oppdages ved å lyse felt mikroskopi og bekreftet etterpå av konfokalmikroskopi. De kreftceller invadere inn i hjernen skive, noe som er sammenlignbart med den virkelige in vivo situasjon og til en observasjon gjort av Baumert og kolleger, som fant et infiltrasjonssone i 63% av obduksjons tilfeller med hjernemetastaser 21.
På grunn av den manglende blod perfusjon, er det bare hørende makrofager / mikroglia i denne kulturen. Videre, på grunn av de mIssing T-celler, og derfor fraværende allo-reaktivitet, menneskelige karcinomceller kunne brukes til coculture selv med hjernen skiver av immunkompetente mus eller rotter (NMRI, B6, eller Wistar). Dette kan tjene som et alternativ til den naken mus-modellen. Etter 4-5 skiver kan fås fra hver mus, blir betydelig redusert antall dyr er nødvendig, sammenlignet med de eksisterende innsprøytningsmodeller. I tillegg trenger dyrene ikke lide for en lang periode med metastatisk sykdom, og de ikke gjennomgår operative prosedyrer gjentagelser 22.
Med dette coculture system har vi vist at aktivering av mikroglia av kreftceller, og kapasiteten til å fremme kreftcelle invasjon. I tillegg er dette den første gangen, så vidt vi vet, ble mikroglia funnet å aktivt transportere karcinomceller 23.
Til tross for alle disse fordelene, har coculture system, ja, også begrensninger. Det er fortsatt et in vitromodellere mangler trinnene av metastasering før kolonisering. På grunn av den manglende perfusjon, er det ikke mulig å studere ekstravasasjon. Således er den alternative måte å studere ekstravasasjonen å bruke enten in vivo injeksjon modellen eller den modifiserte Boyden kammer system med ekstracellulær matrise, HUVEC og astrocytter å etterligne den blod-hjernebarriere 22,24. Hjernen skive coculture metoden er ennå en pålitelig og reproduserbar modell med mange fordeler og et potensial for en rekke programmer, som for eksempel analyse av kolonisering, særlig med fokus på rollen til de fastboende celler. Kombinasjonen med andre etablerte teknikker (for eksempel immunhistokjemi, konfokalmikroskopi og time-lapse mikroskopi) støtter etterforskningen av direkte celle-til-celle interaksjoner. Det er et enkelt alternativ og complementation av andre teknikker, og tilbyr tilgang til etterforskningen av de signaler og effekter som følger av metastatisk mikromiljøet.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Chalid Ghadban for hans utmerkede teknisk assistanse, Andreas Wodarz og Stephan Heermann for deres tekniske råd om confocal og time-lapse mikroskopi. Det er ingen interessekonflikt for noen av forfatterne. Dette arbeidet er finansiert av den tyske Research Council (DFG) i Project 2 av Forschergruppe 942 (FOR942 BI 703/3-1), av Dres. Bayer-Stiftung (Baden Württembergischer Krebspreis, Tyskland) og ved Research Program for Det medisinske fakultet, Georg-August-universitetet Göttingen, Tyskland.
Material Name | Company | Catalogue number | Comment |
Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco, Darmstadt,Germany | 24020 | |
Minimum essential medium (MEM) | Gibco, Darmstadt , Germany | 32360 | |
RPMI-1640 | PAA Laboratories Inc., Cölbe, Germany | E15-840 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Pan Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 | |
Normal horse serum (NHS) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 16050-122 | |
Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10091148 | |
Glucose | B. Braum, Melsungen, Germany | ||
L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution | Sigma, Steinheim, Germany | G1146 | |
Vibratome | Leica, Wetzlar, Germany | Leica VT1200S | |
Microtome | Leica, Wetzlar, Germany | Leica SM 2000R | |
Polycarbonate membrane | BD Falcon, Heidelberg,Germany | 353090 | transwell membrane insert (0.4 μm pore size) |
ECM gel | Trevigen, R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany | 3432-005-01 | Basement membrane extract |
Metallic spacer | Kig GmbG, Kirkel, Germany | DIN 433 | |
Confocal microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | LSM 510 | |
Time-lapse microscope and camera | Leica, Wetzlar, Germany | DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera | |
Anatomy microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | Stemi SV11 | |
Paraformaldehyde | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04005.1000 | |
Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody | Sigma, Steinheim, Germany | G3893 | |
Goat anti-mouse IgG, F(ab')2– TRITC | Santa Cruz, Heidelberg, Germany | SC3796 | |
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 132450 | |
DAPI (4',6'-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride) | Sigma, Steinheim, Germany | D8417 | |
Fluorescent mounting medium | DAKO, Glostrup, Denmark | S3023 |