칼슘의 평가는 그대로 골격 근육 섬유에서 불꽃

Summary

직접 칼슘 불꽃을 측정하는 방법이 여기에 설명, 칼슘 ^{2 +의} 기본 단위는 그대로 골격 근육 섬유의 근질 세망에서 놓습니다. 이 방법은 고립 된 근육 섬유의 ryanodine 수용체에서 칼슘 ^{2 +} 릴리스의 삼투 스트레스 매개 트리거를 사용합니다. 역학과 내 Ca ^{2 +} 신호 전달의 항상성 용량은 건강과 질환에서 근육 기능을 평가하기 위해 사용될 수있다.

Abstract

항상성 칼슘 ^{2 + 신호를} 유지하는 것은 살아있는 세포의 기본적인 생리적 과정이다. 칼슘 ^{2 +} 불꽃은 매우 근질 세망 (SR) 막에 채널을 해제 ⁺ (RYR) CA ryanodine 수용체에 의해 매개되는 칼슘 ^{2 +} 출시 이벤트 ^2를 지역화 나타나는 가로 무늬 근육 섬유에 신호 ^{+ 칼슘의} 기본 단위입니다. 적절한 평가 근육의 칼슘 ^{2 +} 불꽃 건강하고 병에 걸린 줄이있는 근육의 세포 내 칼슘 ^{2 +} 처리 특성에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다. 칼슘 ^{2 + 이벤트는} 일반적으로 휴면 심근 볼 수있는 불꽃 있지만, 그들은 거의 골격근 섬유 휴식에서 관찰되며, 따라서 골격근 섬유에서 스파크를 생성하고 분석하는 방법에 대한 필요성이있다.

여기에 상세한 F를 사용하여 격리 된 굴근 digitorm 브레비스 (FDB) 근육 섬유에 칼슘 ^{2 +} 불꽃을 측정하기위한 실험 프로토콜입니다luorescent 칼슘 ^{2 +} 인 지표 및 레이저 스캐닝 공 초점 현미경. 이 방법에서는, 고립 된 FDB 섬유는 등장 성 생리 솔루션에 반환 한 다음 과도 hypoosmotic 스트레스에 노출되어 있습니다. 이러한 조건에서, 강력한 칼슘 ^{2 +는} 응답이 젊은 건강한 FDB 근육 섬유 소재 sarcolemmal 막에 인접한 감지 불꽃. 변경된 칼슘 ^{2 +는} 응답이 이영 또는 세 골격 근육 섬유에서 검출 불꽃. 이 방법은 최근에 막 분리 된 신호 이노시톨 사이의 크로스 토크 (cross-talk) (1,4,5)-삼인산 수용체 (IP ₃ R)와 관련된 것을 증명하고 RYR 캘리포니아 골격근 ^{2 +} 불꽃의 활성화에 기여한다. 요약하면, 삼투압 스트레스를 사용하여 우리의 연구는 칼슘을 유도 ^{2 +} 불꽃이 세포 내 반응은 근육 생리학 메커니즘을 신호와 마우스 근육 영양 장애의 모델 (MDX 마우스) 또는 근 위축성 측삭 경화증 (ALS 모델 포함 / 질병 상태, 노화를 반영하는 것으로 나타났다).

Introduction

세포 내 무료 칼슘 ^{2 +} ([칼슘 ^{2 +]} _I) (검토를 위해 Stutzmann과 맛 토손 ¹ 참조)와 같은 신경, 심장, 골격 및 평활근과 같은 흥분 세포에서 여러 세포 기능을 조절하는 다양하고 중요한 보조 메신저입니다. 근질 세망 (SR) 및 T-세관 사이에 칼슘 ^{2 +} 동원 및 크로스 토크 (cross-talk)를 규제 (TT) 멤브레인은 근육 생리학의 기본 레귤레이터이다. 또한, 칼슘 ^{2 +} 신호의 변화는 다양한 근육 질환의 수축 기능 장애의 기본 메커니즘으로 표시했다.

칼슘 ^{2 +} 불꽃이 근질 세망 (SR) ^막에 대한 ryanodine 수용체 (RYR) 채널의 오프닝에서 발생하는 초등학교 칼슘 ^{2 +} 출시 이벤트를 지역화됩니다. 심장 근육에, 불꽃은 칼슘 ^{2 +에} 의한 ^{칼슘 +} RELE으로 RyR2 채널의 개방을 통해 자발적으로 발생ASE (CICR) 메커니즘 ^3-5. 골격근에서 RyR1 엄격히 TT 멤브레인 ^6,7에서, 전압 센서에 의해 제어된다. 그대로 골격 근육 섬유의 휴식 조건에 따라서 칼슘 ^{2 +} 불꽃이 억제되어 거의 검출되지. ⁺ 골격 근육 ^8,9 검출 할 이벤트를 촉발를 최근까지, 필요한 sarcolemmal 막은 RyR1의 전압 센서의 억제를 풀다하기 위해 다양한 화학 물질 또는 기계 "스키닝"방법에 의해 중단 될 수 및 ^칼슘 허용. 하나의 방법은 이전에 사포닌 세제 ^(10)에 의해 근육 섬유의 멤브레인의 필수 permeabilization을 설명했다.

2003 년, 우리는 과도 hypoosmotic 스트레스 또는 고 삼투압 스트레스 중 하나는 ^{2 +은} 그대로 근육 섬유 ^(11)의 sarcolemmal 막에 인접한 불꽃 주변 칼슘을 유도 할 수 있다는 것을 발견했다. 이 방법은 이후 칼슘 ^{2 +의} 분자 메커니즘 및 변조를 연구하도록 수정되었습니다 12-16. 여기에서 우리는 그대로 골격 근육에있는 칼슘 ^{2 +} 불꽃의 유도, 탐지 및 분석을위한 우리의 실험 방법의 세부 사항을 설명합니다. 우리는 또한 골격 근육, 예를 들어 불꽃 주파수와 진폭 RYR 채널의 개방 가능성을 반영 (Δ F/F0, 개별 칼슘 ^{2 +} 불꽃의 원소 속성을 정량화하는 데 사용할 수있는 우리의 맞춤형 스파크 분석 프로그램을 제시하고 SR 내부의 칼슘 ^{2 +로드),} 피크 시간 (상승 시간) 및 기간 (FDHM, 스파크의 절반 최대 진폭의 전 기간)뿐만 아니라, 칼슘 ^{2 +} 불꽃의 공간적 분포. 또한, 우리는 근육 퇴행 위축과 근 위축성 측삭 경화증과 같은 골격 근육의 다양한 병태 생리 학적 상태에 칼슘 ^{2 +} 불꽃을 변경 링크 증거를 제시한다.

이 기술의 장점은 상대적 undam에서 칼슘 ^{2 +를} 측정하는 능력을 포함대신, 근육 섬유가 벗겨진 생리적으로 조건에서 기록의 Ca ^{2 +} 불꽃 가까이 허용의 세 세포. 또한, 우리의 맞춤 설계 프로그램은 근육 섬유 관련하여 불꽃의 특성을보다 정확하게 계산을 제공합니다.

Protocol

1. 삼투 스트레스 관류 시스템 설정

그림 1은 칼슘의 개략적 인 프로토콜이 그대로 골격 근육 섬유에 평가를 불꽃입니다.

1. 두 채널의 최소 함유 관류 시스템의 출구 끝을 위치시킬 세 축 (XYZ) 미세 조작기를 설정. 방법 루어 - -에 및 / 또는 관류 솔루션의 흐름을 끄려면 코리아 크레인이 부착 된 세 개의 일회용 주사기 루어 배럴로 만들어 질 수 있었다. 이러한 관류 채널> 0.2 mm 직경 단일 팁을 통해 관류 액> 1 ㎖ / 분을 전달할 수 있어야한다.
2. 관류 시스템, 저장성 타이로드 솔루션을 등장 성 타이로드 해결 한 다른 두 개의 채널을로드합니다.

2. 마우스에서 준비 본래대로 단일 굴근 심지 브레비스 (FDB) 근육 섬유

1. 마우스 유럽 연합 (EU)에서 발을 제거발목 관절 위의 다리를 절단하여 무거운 해부 가위를 사용하여 NIH와 IACUC 지침에 따라 thanized.
2. 발바닥면이 위를 향하고 최소한의 칼슘 ^{2 +} 타이로드 솔루션으로 가득 해부 실에 발을 핀.
3. 힘줄 절단 조심스럽게 주위 조직에서 근육을 분리하는 힘줄을 당겨 FDB를 해부하다.
4. 근육의 깊은 층에 각각의 자리에가 가지 말초 힘줄을 절단하여 절개를 마칩니다.
5. 근육 섬유에 추가 손상을 방지 및 콜라게나 소화 솔루션의 해동 나누어지는이있는 튜브에 배치하기 위해 힘줄을 통해 집게와 함께 선택하여 FDB 근육을 이동 37 ℃로 데워진
6. 160 rpm의 속도로 60 ~ 90 분 동안 37 ° C에서 진탕에 똑바로 FDB를 포함하는 튜브를 품어. 이 근육 번들 해리 프로토콜 실험적 동물의 다른 균주에 대해 검사 될 필요특히 막 손상에 취약 그 질병 / 돌연변이 섬유.
7. 등장 성 타이로드 솔루션의 700 μL와 튜브에 소화 FDB를 전송하고 부드럽게 팁을 제거하기 위해 점차적으로 깨끗한 면도날로 절단을 통해 직경을 감소 200 ㎖ - 마이크로 피펫 팁의 시리즈를 통해 근육을 여러 번 그려 섬유를 해제 씹다 200 ㎖의 마이크로 피펫의. 질병에서 특히 약한 근육에 손상 섬유를 방지하기 위해 끝이 섬유 다발이 고집하지 않고 통과 할 수 있도록 충분히 그냥 큰 있는지 확인합니다. 너무 작은 구멍을 통해 번들을 강요하지 마십시오.
8. 부드럽게 등장 성 1 ㎖를 포함하는 35mm 델타 TPG 요리의 중심에 컷 200 ㎖의 마이크로 피펫으로 도청 및 재현 탁 FDB 섬유 튜브 후 70 ㎖ (총 섬유의 1 / 10)를 인출하여 FDB 섬유를 플레이트 타이로드 솔루션은 요리를 통해 확산을 줄일 수 있습니다.
9. D에 그대로 단일 섬유의 수를 결정해부 현미경을 사용하여 ISH. 접시에 3 ~ 4 그대로 섬유를 얻기 위해 FDB 섬유의 추가 분취를 추가합니다.
10. 4 ° C에서 추가 격리 된 근육 섬유를 저장하고 6 시간 이내에 사용한다.

3. FLUO - 오전 4시 염료 로딩 및 CA ^{2 +} 영상 (스파크 측정)

1. 관 10 ㎖ 플루오 (Fluo) - 오전 4 주식 (1 ㎜)과에 전송 도금 FDB 섬유와 요리에서 등장 성 타이로드 용액 500 ㎖를 혼합하고 10 mm의 최종 플루오 (Fluo) - 오전 4 농도에 요리에 다시 추가합니다. 또는, 플루로 닉 산 염료 적재 효율을 증가시키기 위해 사용될 수있다.
2. 어둠 속에서 실온에서 60 분 동안로드합니다.
3. 주의 깊게 자르지 200 ㎖의 플라스틱 마이크로 피펫 팁과 요리에서 플루오 (Fluo) - 오전 4 함유 등장 성 타이로드 용액 500 ㎖를 그려 섬유를 세척하고 신선한 등장 성 타이로드 솔루션의 동일한 볼륨으로 교체.
4. 이 과정을 3 번 이상 반복합니다.
5. 미토콘드리아의 기능을 시각화하기 위해, 동위 원소 500 ㎖를 전송관 5 ㎖ TMRE 재고 (1 ㎜)로, 혼합, 50 nm의 최종 농도에 다시 요리에 추가로 FDB 섬유와 요리에서 NIC 타이로드 솔루션.
6. 10 분 동안 실온에서 배양한다.
7. 주의 깊게 500 ㎖를 그려 섬유를 세척 TMRE 함유 포경 200 ㎖의 플라스틱 마이크로 피펫 팁과 요리에서 등장 성 타이로드 솔루션 신선한 등장 성 타이로드 솔루션의 동일한 볼륨으로 교체.
8. 이 과정을 3 번 이상 반복합니다.
9. 공 초점 현미경에 접시를 전송하고 선명한 줄무늬와 실험을위한 부드러운 sarcolemmal 막과 그대로 섬유를 선택합니다.
10. 미세 조작기 컨트롤을 사용하여 멀리 대상 근육 섬유에서와 중앙 오프 관류 시스템을 400 ~ 500 μm의 끝을 배치합니다.
11. FDB 섬유는 그 자리에 체재 확인하기 위해 등장 성 타이로드 솔루션의 흐름을 시작합니다.
12. 40X 기름 침지 목적으로 플루오 (Fluo) -4에서 오전 형광 신호를 기록하고와 플루오 (Fluo) -4 오전 흥분아르곤 레이저 (여기 파장 488 nm의) 기록 방출 신호 (파장 510-580 nm의). 형광 신호의 세기는 내 Ca ^{2 + 농도} ([칼슘 ^{2 +]} _I)의 상대 레벨에 비례한다.
13. 섬유상의 삼투압 스트레스를 생산하기 위해 세포 외 용액의 삼투압을 변경하여 칼슘 ^{2 +} 과도 상태를 유도한다. 처음에 붓기를 유도하기 위해 100 초 저장성 타이로드 용액 (170 mOsM)와 다음 등장 성 타이로드 용액 (290 mOsM) (60 초 기준 컬렉션)와 섬유를 perfuse합니다. 등장 성 타이로드 용액으로 FDB 섬유를 확대 Perfuse. 일반적으로, 오직 하나의 삼투압 충격 한 델타 TPG 접시 단일 그대로 섬유와 스파크 이벤트 데이터 수집을위한 마지막 10 분에 적용된다.
14. 166 LPS (초당 라인, 그리고 EA의 스캔 속도와 XY 이차원 이미지의 시계열을 사용하여 칼슘 ^{2 +} 불꽃 (그림 2)의 기록 공간 현지화등장 (1 분 각각의 조건에 대해 3.08 초 / 프레임의 결과로 512 픽셀)로 구성 채널 라인), 저장성 스트레스 (100 초) 및 사후 저장성 스트레스 (5 분). 오프라인 분석을 위해 저장 신호는 실험 종료 후 칼슘 ^{2 +} 불꽃의 분포 및 빈도를 알아보고자 하였다.
15. 새 접시에 새 섬유를 찾아 칼슘 ^{2 +} 과도을 유도하기 위해 동일한 삼투압 충격 프로토콜을 따릅니다. 직접 sarcolemmal 막 아래에 배치 된 공 초점 주사 라인 일분 (즉, 30,000 라인)에 대한 칼슘 ^{2 +} 과도를 기록하는 공 초점 라인 스캔 (XT) 모드 (길이 512 픽셀, 2 밀리 초 / 라인 스캔의 샘플 속도를 사용하여 (그림 3 ). 개별 칼슘 ^{2 +} 불꽃의 크기와 반응 속도의 분석을위한 linescans의 1 분 간격으로 세 가지를 순차적으로 ()을 기록하기 위해 서로 다른 초점 비행기로 라인 스캔을 변경합니다.

4. 데이터 분석

1. 다수 상환, 피크 시간 (FDHM에 시간, 상승 시간, XT 라인 스캔, 개별 칼슘 ^{2 +} 불꽃 매개 변수의 형태와 반응 속도를 평가 진폭, 즉 (F ₀ 휴식 칼슘 ^{2 +} 형광입니다 F / F _0)에 추적 , 절반 크기의 전체 지속 시간), 기록 된 스파크의 공간 폭 (FWHM, 절반 크기의 전체 폭). 이러한 매개 변수는 칼슘 ^{2 +} 플럭스 (진폭)와 같은 RYR 칼슘 ^{2 +} 채널의 기본 게이트의 속성을 나타내고, RYRs (기간)의 게이트 속도론.
2. 이전에 ^11,16 바와 같이, 이미지 프로세싱 언어 IDL (대화 형 데이터 언어)을 사용하여 만든 사용자 정의 개발, 반자동 알고리즘으로 디지털 이미지 데이터를 분석합니다. 칼슘 ^{2 +의} 고유 반응 속도는 삼투압 스트레스에 의해 FDB 섬유에 의한 ^{칼슘 +} 스파크의 경우에 방출하기 때문에 ^{2 +} 이벤트를 촉발 CA의 수동 및 자동 기능을 결합하는 것이 좋습니다이러한 사용자 지정 빌드 이미지 분석 프로그램 ¹¹ 식별 및 처리. 그것은 수동으로 일부 근육 질환 모델에서 ROI (관심 지역)를 식별하는 것이 필요 할 때이 알고리즘은 매우 유용합니다. 투자 수익 (ROI)이 정의되면,이 알고리즘은 자동으로 다음 Excel 파일로 내보낼 수 있습니다 위에서 언급 한 불꽃 매개 변수를 도출 할 수 있습니다. 대안 적으로, 공개 가능 화상 처리 소프트웨어, ImageJ에있는 예 SparkMaster는 칼슘 ^{2 +} 불꽃의 운동 특성과 골격근 ^{(17)에서의} 공간 분포를 정의하는데 사용될 수있다.

Representative Results

이전 연구는 과도 hypoosmotic 스트레스 ⁺ 주변 칼슘 ^11. 그림 1은 부드러운 sarcolemmal 막과 특성 분명 줄무늬와 그대로 하나의 근육 섬유의 이미지를 보여줍니다 그대로 근육 섬유의 sarcolemmal 막에 인접한 ² 불꽃에 의한 것으로 나타났다. 그림 2는 전형적인 칼슘 ^{2 +} 표시 (XY 이미지) 불꽃은 젊고 건강한 쥐에서 FDB 근육 섬유를 팽윤 hypoosmotic 솔루션 과도 (100 초) 처리에 의해 유도 하였다. 근육 섬유가 다시 원래 부피 수축 같이, 강력한 칼슘 ^{2 + 스파크} 응답 직접 근육 섬유의 sarcolemma하에있을 것이다. 이 XY 이미지가 불꽃 주파수를 계산하고이 응답의 붕괴 프로파일을 그리는 데 사용됩니다. 3 스파크 분석이 모드로 생성 된 전형적인 라인 스캔 (XT)를 보여줍니다. 공 초점 스캔 라인은 직접의 아래에 있습니다sarcolemmal 막 (그림 3A). 스파크 이벤트의 시계열이 캡처되어 지정된 로아 (관심 지역) 우리의 사용자 정의 개발, 반자동 "스파크에 맞는"프로그램 (그림 3B)로 식별 할 수있다. 그림 3C는 진폭의 전형적인 불꽃 맞춤 분석을 보여줍니다 주어진 칼슘 ^{2 + 불꽃의} 반응 속도. 칼슘 ^{2 +} 스파크 강도를 플루오 (Fluo) -4 오전 신호의 진폭 변화 (F 피크 플루오 (Fluo) -4의 강도이고 F ₀ 스파크가 발생하기 전에 쉬고 플루오 (Fluo) -4 강도를 Δ F / F, _0)으로 산출된다. 스파크의 재생 시간은 FDHM (절반 정도의 전체 재생 시간) 및 상승 시간뿐만 아니라 또한 계산 될 수 피크하는 시간에 의해 표시된다. 일반적인 3D (입체) 표현은 칼슘 ^{2 +} 농도 변화 (그림 3D)을 보여주기 위해 지정된 로아에서 할 수있다. 그림 4는 칼슘 ^{2 +} 불꽃의 이미지를 보여줍니다다른 생리 학적 및 병태 생리 학적 상태에서 골격 근육 섬유에서 linescans. 건강, 젊은 (3 개월)에서 파생 된 야생형 근육 (그림 4A)과 세 (22 개월) 근육 (그림 4B) 칼슘 ^{2 +} 불꽃의 라인 스캔 (XT) 시리즈. 세 근육 섬유에서 발생하는 감소 된 신호를합니다. 젊은 MDX 근육 섬유가 강력한 칼슘 ^{2 +} 불꽃 (그림 4C)를 표시합니다. 그림 5는 보여줍니다 신근 심지 롱 (EDL) 근육 야생형 섬유 (그림 5A) 및 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)에서 칼슘 ^{2 +} 불꽃 (XY 이미지) 질병 특성 근육 위축 및 손상된 미토콘드리아 (그림 5B)과 운동 신경 질환. 칼슘 ^{2 +} 농도는 플루오 (Fluo)-4 신호 (녹색, 왼쪽 패널)와 호흡 상태가 TMRE 신호 (빨강, 오른쪽 패널)에 의해 표시되는 미토콘드리아에 의한 표시입니다. 그 t을 참고그는 강력한 칼슘 ^{2 +} 불꽃을 품고 (TMRE 신호 손실) 미토콘드리아를 손상.

그림 1. 칼슘의 도식 프로토콜은 그대로 골격 근육 섬유에 평가를 불꽃. 칼슘의 회로도 프로토콜이 그대로 골격 근육 섬유에 평가를 불꽃. 이 분석 및 섬유에 삼투 스트레스를 유도하는 관류 시스템의 셋업을위한 그대로 FDB 근육 섬유를 얻기 위해 단계별 절차를 보여줍니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2. 대표 칼슘 ^{2 +} 불꽃 (XY 이미지) 골격 FDB 근육 섬유의 에피소드. 중간 추적 프로토콜의 연속 삼투압 변화에 대한 타임 라인과 해당 XY 이미지 (상단 패널)를 보여줍니다. 맨 왼쪽 패널 - 섬유 등장 성 타이로드 용액으로 처리, 상단 가운데 패널 - 저장성 타이로드 용액으로 처리 섬유, 그리고 오른쪽 상단 패널 - 섬유는 등장 성 타이로드 용액으로 처리에 돌려 보냈다. XY 영상으로 관찰 스파크 에피소드의 대표 히스토그램은 하단에 표시됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3. 대표 칼슘 ^{2 + 스파} RKS (라인 XT 이미지를 스캔) 및 맞춤 분석 스파크 (A) 공 초점 라인 스캔 (빨간 점선)가 바로 근육 섬유의 sarcolemmal 막 아래에 배치됩니다. (B) 삼투 스트레스가 ^{2 +} 불꽃이 라인 스캔으로 표시하고 별도의 칼슘을 유발 (XT) 모드. 스파크 맞춤 SR 칼슘 ^{2 +} 유출을 해제에 비례하는 칼슘 ^{2 +} 강도 (Δ F / F _0)를 입증하는 알고리즘과 반응 속도 (FDHM로 표시 기간,)와 (C) 스파크 분석. (D) 공간 - 시간 모드와 그 강도에 삼투 스트레스 유발 불꽃을 보여주는 플루오 (Fluo) - 4 라인 스캔 이미지의 3 차원 플롯. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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그림 4. 삼투압 스트레스에 대한 응답으로 근육의 대표 칼슘 ^{2 +} 불꽃 생리 및 병리 생리 학적 상태에 젊은에서 파생 된 칼슘 ^{2 +} 불꽃의 (A) 라인 스캔 (XT 이미지) (3 개월) 건강 FDB 근육 섬유;. (B)는 (세에서 불꽃 22 개월) FDB 근육 섬유와 (C)는 젊은 (3 개월) 이영의 MDX 마우스 FDB 근육에서 불꽃. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 5. 대표 카 삼투압 스트레스에 대한 응답으로 FDB 근육에서 ^{2 +} 불꽃 (XY 이미지). (A 2 + 불꽃 야생형 FDB 근육에서 (XY 이미지)와 ALS 근육에서 (B) 칼슘 ^{2 +} 불꽃. 동시에 플루오 (Fluo) - 오전 4시으로 표시 FDB 근육 섬유 중 (Ca ^{2 +,} 녹색 신호, 왼쪽 패널)와 TMRE (미토콘드리아, 오른쪽 패널에 빨간 신호). 이미지는 삼투압의 변화 이전과 이후 과도을 보여줍니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

Discussion

그대로 골격 근육에 칼슘 ^{2 +} 불꽃을 평가하는이 방법은 근육의 생리 및 질병 연구를위한 유용한 도구입니다. 우리는 칼슘 ^{2 +} 스파크 응답 ^{(18, 19)뿐만 _아니라,} 근 위축성 측삭 경화증 ^(20)을 에이징, 근이영양증 ⁽¹¹⁾ 등, 다른 조건으로 변경 한 것으로 나타났다. 우리의 최근의 연구는 또한 캘리포니아에 골격 근육 섬유 ^{(21) 2 +} 불꽃 활성화를 기여하는 중요한 구성 요소를 나타내는 IP ₃ 수용체와 RYR 사이의 기능적인 커플 링을 공개했다. 다른 여러 연구 그룹은 기능적 활동과 이영 근육 ^(12)의 유전자 구조 전략의 효과를 탐구하고, 일부 질병 상태 ^13,22에서 변경된 산화 환원 스트레스 신호 촉발 ⁺ 칼슘 ^2를 연결하는이 기술을 적용. 삼투 스트레스에 의해 막 변형 RYR 대응에 DHPR의 억제를 완화한다는 사실LATES 잘 골격근 ²³ 차별에 칼슘 ^{2 +} 불꽃을 조절에 DHPR-RYR의 물리적 상호 작용 (커플 링)의 필수적인 역할을하며, 따라서 이러한 연구 결과 또한 칼슘 ^{2 +} 불꽃 같은 중요한 생리 학적 사건 연루. 칼슘 ^{2 +} 불꽃을 조절하는 몇 가지 생리 학적 대리인 또는 억제제를 적용하려면이 기술의 추가 확장은 셀 ^(24)에 신호 ^{+ 칼슘에} 대한 통찰력있는 정보를 제공합니다.

우리의 분석의 가장 중요한 단계는 칼슘 ^{2 +} 염료를로드하기 전에 현미경 그대로 근육 섬유를 분리하고 확인하는 것입니다. 이 프로토콜에서 하나의 중요한 단계는 이러한 조건이 잠재적 섬유 분리 중에 세포막 손상을 렌더링 할 수 변경 등의 콜라게나 제 소화 시간 및 온도이다. 섬유 단단히 _ 델타 TPG 접시의 바닥에 부착 특성 직선, 막대와 같은 모양, 70 ~ 100의 크기로 그대로 형태를 표시해야합니다6, m (길이) 및 8-18 μm의 (크로스 직경), 균일 한 횡문 패턴과 칼슘 ^{2 +} 불꽃 측정에 유용 할 수있는 부드러운 sarcolemmal 막. 데이터 수집 이전 제한에 따라 개선 칼슘 ^{2 +} 불꽃의 가능한 한 가장 정확한 측정 값을 캡처하기 위해 각 섬유 내에서 여러 개의 초점 평면에서 측정을하고있다. 우리가 불꽃 주파수, 역학 및 특성을 분석하기 위해 사용자 지정 파생 된 "불꽃 맞춤"알고리즘을 사용하지만, 유사한 프로그램은 ImageJ에 ¹⁷ "SparkMaster"로 불꽃 매개 변수 특성을 분석하기위한 공개 도메인을 사용할 수 있습니다. 이 방법에 약간의 수정은 삼투압 스트레스에 반응 다른 조직 유형 ^{2 +} 불꽃 ryanodine 수용체에서 출시 ⁺ 칼슘 ^2를 트리거 매개 칼슘의 더 나은 시각화를 허용 할 수 있습니다.

성인 골격 근육 섬유에서 로컬 및 글로벌 칼슘 ^{2 +} 신호의 시각화 FO 매우 유용한 도구입니다R 근육 생리학과 심장 혈관 연구. 함께 인간의 질병 연구 및 강력한 분자 생물학의 접근 방식 (예를 들면 유전자 과발현 또는 유전자 침묵)의 구현의 다른 동물 모델과 골격 근육에있는 칼슘 ^{2 +} 불꽃의 탐지를위한이 방법의 확장은 칼슘 ^{2 +의} 규정에 광대 한 정보를 생성한다 인간의 건강과 질병의 신호.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60 mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become a clear, colorless solid substrate.
60 mm glass Petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 Axis Micromanipulator	Narishige International	MHW-3
Temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation