Cel Patterning op fotolithografisch Defined Parylene-C: SiO₂ Substrates

Summary

Dit protocol beschrijft een microfabrication-compatible methode voor cel-patroon op SiO _2. Een vooraf gedefinieerde Parylene-C ontwerp wordt fotolithografische gedrukt op SiO ₂ wafels. Na incubatie met serum (of andere activering oplossing) cellen specifiek hechten aan (en te groeien volgens de conformiteit van) onderliggende parylene-C, terwijl wordt afgestoten door SiO ₂ regio's.

Abstract

Cel patronen platformen ondersteunen brede onderzoeksdoelen, zoals de bouw van voorgedefinieerde in vitro neuronale netwerken en de exploratie van bepaalde centrale aspecten van de cellulaire fysiologie. Naar cel patronen gemakkelijk te combineren met Multi-elektrode arrays (MEA's) en op basis van silicium 'lab op een chip' technologieën, is een microfabrication-compatibele protocol vereist. We beschrijven een methode die afzetting van het polymeer parylene-C op SiO ₂ wafels gebruikt. Fotolithografie maakt een nauwkeurige en betrouwbare patroonvorming van parylene-C op micron-niveau resolutie. Na activering door onderdompeling in foetaal runderserum (of een andere specifieke activatie oplossing) resulteert in een substraat waarin gekweekte cellen hechten aan, of respectievelijk afgestoten door, paryleen of _SiO2 gebieden. Deze techniek heeft het mogelijk patroonvorming van een breed scala aan celtypen (inclusief primaire murine hippocampale cellen, HEK 293-cellijn, menselijk neuron-achtige teratocarcinoomcellijn, primaire muizen cerebellaire granule cellen en primaire menselijke-glioma afgeleide stam-achtige cellen). Interessant is echter het platform niet universeel, gezien het belang van celspecifieke adhesiemoleculen. Deze cel patronen proces is effectief, betrouwbaar kost, en belangrijker kan in standaard microfabrication worden opgenomen (chip industrie) protocollen, de weg vrijmaakt voor de integratie van micro-elektronische technologie.

Introduction

Begrip mechanismen die celadhesie en patroonvorming dicteren kunststoffen is belangrijk voor toepassingen zoals tissue engineering, drug discovery, en de fabricage van biosensoren ^1-3. Vele technieken zijn beschikbaar en evolueren, elk gebruik te maken van de talloze biologische, chemische en fysische factoren die celadhesie beïnvloeden.

Hier beschrijven we een cel-patronen techniek die processen in eerste instantie ontwikkeld voor micro-elektronische fabricage doeleinden gebruikt. Als zodanig is het platform is goed geplaatst om de downstream-integratie van micro-elektronische technologieën, zoals MEA staat, in de patroonvorming platform.

De interface tussen een celmembraan en een aangrenzende materiaal is bidirectioneel en complex. In vivo, extracellulaire matrixeiwitten zorgen voor structuur en sterkte en effect op celgedrag via interacties met celadhesie receptoren. Ook cellen in vitro interactie met synthetische substraten via geabsorbeerd lagen van eiwitten ⁴ terwijl fysisch-chemische invloeden ook hechting moduleren. Bijvoorbeeld, een polymeer oppervlak kan meer "bevochtigbaar" (hydrofiele) van ionen of ultraviolet licht bestraling of etsen gemaakt door behandeling met zuur of hydroxide ^5. Gevestigde methoden voor mobiele patroonvorming profiteer van deze en andere cel adhesie mediators. Voorbeelden zijn inkjet printen ^6, microcontact stempelen ^7, fysieke immobilisatie ^8, microfluidics ^9, real-time manipulatie ^10, en selectieve moleculaire assemblage patroonvorming (SMAP) ^11. Elk heeft specifieke voordelen en beperkingen. Een belangrijke drijfveer in ons werk, is echter naar cel patronen te integreren met micro-elektromechanische systemen (MEMS).

MEMS verwijzen naar zeer kleine mechanische apparaten aangedreven door elektriciteit. Dit overlapt met de nanoschaal equivalent, nanoelectromechnische systemen. Dit concept werd praktisch alleen als halfgeleider strategieën mogelijk fabricage plaatsvinden op de microschaal. Microfabricage technieken oorspronkelijk ontwikkeld voor de halfgeleider elektronica onbedoeld bruikbaar voor andere toepassingen zoals cellulaire elektrofysiologie bijvoorbeeld gevonden. Een belangrijke downstream doel is om dergelijke micro-elektronische technologieën met een high fidelity cel patronen proces (het vormen van een bioMEMS apparaat) te combineren. Verschillende bestaande en anders betrouwbare en praktische cel-patronen technieken verenigbaar zijn met dit idee. Bijvoorbeeld nauwkeurige uitlijning van elke ingebedde micro of biosensoren is fundamenteel voor hun doeltreffendheid maar is zeer moeilijk te bereiken met behulp van een techniek zoals microcontact stempelen.

Om dit probleem te omzeilen, zijn we bezig met een SiO _2-gebaseerde patronen platform dat fotolithografisch gedrukt parylene-C gebruikt. Fotolithografie impliceert overdracht van geometrische kenmerken vaneen masker op een substraat via UV belichting. Een masker is ontworpen met behulp van een geschikte computer-aided design programma. Bij een glasplaat, een dunne laag ondoorzichtige chroom vertegenwoordigt de gewenste geometrisch patroon (een kenmerk resolutie van 1-2 mm mogelijk). Het substraat een patroon wordt bedekt met een dunne laag fotolak (een UV-gevoelige polymeer). De beklede polymeer wordt vervolgens uitgelijnd en gebracht in nauw contact met het masker. Een UV bron zodanig dat onbeschermde gebieden bestraald toegepast en derhalve oplosbaar en verwijderbaar te worden in de volgende ontwikkelingsstap waardoor een parylene-C weergave van het maskerpatroon achteren. Dit proces ontstaan ​​tijdens de ontwikkeling van halfgeleiderinrichtingen. Als zodanig zijn silicium wafers vaak gebruikt als substraat. Photolithographic afzetting van parylene-C op SiO ₂ is dus een eenvoudige en betrouwbare proces dat routinematig plaatsvindt in micro-elektronische cleanroom faciliteiten.

Terwijl parylene heeftverschillende wenselijke biotechniek kenmerken (chemisch inert, niet biologisch afbreekbaar), een beperkende factor zijn directe toepassing in cel patronen is haar aangeboren slechte mobiele hechting, toegeschreven aan zijn extreme hydrofobiciteit. Niettemin Parylene-C is eerder indirect worden gebruikt cel patronen, bijvoorbeeld als afpelbare cellulaire template ^12,13. Deze benadering wordt beperkt door slechte resolutie en vereist meerdere stappen. De hier beschreven werkwijze maar gebruikt een zure etsstap, gevolgd door incubatie serum, zodat parylene-C-gebieden worden cel-lijm, door een combinatie van vermindering van hydrofobiciteit en serum eiwitbinding.

Het eindresultaat is een constructie uit twee verschillende substraten die, na biologische activatie manifesteren respectieve cyto lijm of cyto-afstotende eigenschappen en dus een doeltreffend cel pattering platform. Belangrijk hoeft biologische ag introducerenouders in de cleanroom faciliteit als de substraten kan worden opgeslagen voor onbepaalde tijd vóór gebruik (waarna ze worden geactiveerd met behulp van foetaal serum of andere activering oplossing).

Dit parylene-C/SiO ₂ patronen platform is daarom een goede kandidaat voor een coalitie met MEMS componenten, zoals de fabricage processen zo nauw spiegel die gebruikt worden voor micro-elektronische fabricage.

Protocol

1. Fabricage van Parylene Patronen op SiO 2: Process Flow (zie figuur 1) Ontwerp gewenste Parylene-C-configuratie met een lay-out editor software pakket, geschikt voor het lezen / schrijven van CIF (Caltech tussenvorm) of GDS-II (Graphic Database System-II)-bestanden. CIF en GDS-II zijn standaard industrie bestandsformaten voor geïntegreerde schakeling kunstwerk lay-out. Commissie foto masker produceren om een ​​geschikte micro-elektronica faciliteit, of maak in-huis als faciliteiten bestaan. Oxideren een silicium wafer in een sfeervolle horizontale oven (H 2 1,88 SLM en O 2 1.25 SLM) bij 950 ° C gedurende 40 min tot een 200 nm SiO 2 laag (bevestigen dikte met een kleine plek spectroscopische reflectometer) produceren. Prime de geoxideerde wafer met een silaan adhesiepromotor. Nu storten Parylene-C bij 22 ° C met een snelheid van 1,298 nm / mg dimeer met een vacuüm depositie systeem specifiek ontworpen paryleen storten. A 100nm dik Parylene-coating C werd gebruikt voor alle voorbeelden hieronder. Volgende storting hexamethyldisilazaan (HMDS) adhesiepromotor op de-paryleencoating wafer met een geschikte foto-resist coating systeem. Nu draaien de wafer bij 4.000 rpm gedurende 30 seconden terwijl die positieve fotoresist (resulterend in een theoretische dikte van 1 pm), met hetzelfde fotoresist coating zoals hierboven. Zacht bakken de wafel 60 sec bij 90 ° C. Plaats zowel de wafer en geprefabriceerde foto masker in een masker aligner. Expose de fotoresist gecoate wafer met een UV negatieve voorstelling van de gewenste parylene-C configuratie. Bak blootgestelde wafer gedurende 60 seconden bij 110 ° C. Verwijder alle blootgestelde fotoresistfilm van de wafer door het ontwikkelen in een geschikte ontwikkelaar oplossing. Ets van de onbeschermde paryleen. Gebruik een zuurstof plasma-ets-systeem (bij een 50 mTorr kamerdruk, 49 SCCM O 2, 100 W RF vermogen bij 13,56 MHz, eneen etssnelheid 100 nm / min) om de onderliggende SiO2 onthullen. Snijd de wafer met een geschikte blokjes snijden zaag (toerental 30.000 rpm, voedingssnelheid 7 mm / sec). Spoel chips in gedeïoniseerd H2O en droog blazen met stikstof. Store chips (voor onbepaalde tijd) in stofvrij dozen tot vereist. 2. Chip Reiniging en activering: Protocol Verwijder achtergebleven fotolak van chips door het wassen in aceton gedurende 10 sec. Spoelen in gedeïoniseerd gedestilleerd H2O 3x. Vul verse piranha zuur (een 05:03 verhouding van 30% waterstofperoxide en 98% zwavelzuur). LET OP: Bereid piranha zuur met grote zorg. Het is een zeer krachtige oxidator, sterk zuur en waterstofperoxide mengen met zwavelzuur is een exotherme reactie. Voer deze fase in een zuur zuurkast. Laat 2 minuten te passeren na het mengen van de piranha zuur maar gebruik binnen 20 minuten. Schoon en etsen chips door onderdompeling in piranha zuur gedurende 10 minuten. Spoel chips 3x in gedeïoniseerd H2O en overbrengen in een steriele kweekschaal. Activeer nu chips voor mobiele patronen. Voeg bijvoorbeeld twee chips per putje van een 6-wells plaat en voeg vervolgens 2 ml foetaal bovine serum om zo optimaal genieten van alle chips. Voer deze en alle volgende celcultuur stadia, onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming weefselkweek kap. Incubeer chips in serum gedurende 3-12 uur bij 37 ° C. OPMERKING: Stappen 2,4-2,7 moet sequentieel en zonder vertraging tussen de stappen worden uitgevoerd. Als serum activering wordt vertraagd door ≥ 24 uur na piranha-behandeling, cel patronen is verminderd als gevolg van verminderde cel afstoting van SiO 2 regio's. Alternatieve activatie oplossingen die specifieke cel adhesie eiwitten kunnen worden gebruikt in plaats van foetaal runderserum. Dergelijke oplossingen veranderen de cel-adhesie eigenschappen van de twee contrasterende ondergronden (zie representatieve resultaten voor een voorbeeld). </li> 3. Plating cellijnen On-chip: Protocol Verwijder chips van hun activering oplossing en een keer wassen gedurende 10 seconden in Hank's gebalanceerde zoutoplossing. Plaats chip in een kweekputje en plaat gekozen celtype als een suspensie in de gebruikelijke kweekmedia. Optimale cel plating dichtheid hangt zowel celtype en geometrische patroon van parylene-C op-chip. Een dichtheid van 5 x 10 4 cellen / ml is een verstandig uitgangspunt. Imaging is afgestemd op de onderliggende motivatie voor cel patronen maar levende cel gedrag kan eenvoudig worden beoordeeld met behulp van een dissectie microscoop en een digitale camera met een geschikt relais lens.

Representative Results

De fotolithografische werkwijze van patroonvorming SiO2 met Parylene-C in figuur 1. Na bereiding activering van chips in foetaal runderserum maakt een breed scala aan celtypen worden gevormd in kweek. Onze groep heeft met succes een patroon primaire muizen hippocampuscellen 14-16, de HEK 293 cellijn 17, het menselijk neuron-achtige teratocarcinoom (hNT) cellijn 18, primaire muizen cerebellaire granule cellen en primaire menselijke-glioma afgeleide stam-achtige cellen. Figuur 3 illustreert robuuste patroonvorming van HEK 293-cellen op een parylene patroon bestaande uit ronde knopen met 'cross-hair' extensions. Chip activering in dit voorbeeld was met foetaal runderserum. Daarentegen Figuur 4 illustreert het potentieel om de patroonvorming platform te vergroten door alternatieve activering oplossingen. Met een oplossing van runderserumalbumine (3 mg / ml) en fibronectine (1 ug / ml) in HBSS, heeft de vorige patroon Voorschrift geïnverteerd. Figuur 5 illustreert een ander celtype (een primair van mensen afkomstige stam-achtige cellijn afgeleid van een hoogwaardig glioom). Hier, de geometrie van de onderliggende patroon effecten celgedrag, met de in figuur 4A patroon bevordering celproces groei langs dunne parylene-C circuits zoals weergegeven in figuren 4B en 4C. Sommige celtypen niet patroon bij gebruik van de gevestigde foetaal serum activering protocol. Figuur 6 illustreert 3T3 L1 cellen groeien tot confluentie met geen waarneembare cyto-afstotende of cyto-klevende verschil tussen Parylene-C en SiO 2 regio's. pload/50929/50929fig1.jpg "/> Figuur 1. Stroomdiagram het proces voor de productie van parylene-C patronen op SiO 2. Figuur 2. Flow diagram dat de veranderingen in contacthoek voor gevormde Parylene-C en SiO2 domeinen gedurende chip activeringsstappen. Figuur 3. Beeldvorming van levende cellen van HEK 293-cellen gekweekt op parylene-C/SiO 2 na drie dagen in vitro. Chips gedurende 3 uur in foetaal runderserum waarna cellenuitgeplaat in suspensie in een concentratie van 5 x 10 4 cellen / ml. Parylene-C bevordert cel adhesie terwijl blote SiO 2 afstoot cellen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 4. Beeldvorming van levende cellen van HEK 293-cellen gekweekt op parylene-C/SiO 2 na drie dagen in vitro geactiveerde chips 3 uur in verschillende rationele activatie oplossingen. A: foetaal runderserum, B: vitronectine (1 pg / ml) in HBSS, C: Bovine serum albumine (3 mg / ml) + vitronectine (1 pg / ml) in HBSS, D: Bovine serum albumine (3 mg / ml) + fibronectine (156, g / ml) in HBSS. Cellen werden uitgeplaat in suspensie bij een dichtheid van 5 x 10 4 cellen / ml. Merk op hoe de verschillende behandeling van de chip heeft geleid tot omkering van de vorige patronen dogma, met SiO 2 nu lijm en parylene-C weerzinwekkend. Parylene-C knooppunt diameter van 250 micrometer, aangepast van Hughes et al.. 17 Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 5. Immunofluorescentie beelden van primaire humane-glioma afgeleide stam-achtige cellen gekweekt op verschillende patronen van parylene-C op SiO 2 A:. Schema illustreert de reticulaire parylene ontwerp getoond in B en C </strong> B:.. Fluorescentie microfoto van vaste cellen (na 4 dagen in vitro) gekleurd voor gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) C:. Lichtmicroscopische van levende cellen op dezelfde chip D: Fluorescentie afbeelding illustreert GFAP-gekleurde cellen op een andere parylene . ontwerp E:. Reflectie beeld van het knooppunt en sprak parylene ontwerp afgebeeld in D Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 6. Live cell imaging van 3T3 L1 cellen gekweekt op parylene-C/SiO 2 na vier dagen in vitro. Chips geactiveerd voor 3 uur in foetaal serum na which cellen werden in suspensie (3 x 10 4 cellen / ml). In dit specifieke geval staat het platform niet in staat patronen, met cellen die even samenvloeiing op Parylene-C en SiO 2 regio's. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Onderdompeling van chips in piranha zuur dient niet alleen om eventuele resten van organisch materiaal te verwijderen, maar ook etsen het substraat oppervlakken. Dit is cruciaal voor dat werkelijke activering met foetaal runderserum. Doet u dit niet voorkomt cel-patronen en diepgaand verandert cel gedrag on-chip. Er is geen verplichting om chips te steriliseren na het reinigen met piranha zuur. Inderdaad sterilisatie door UV belichting is aangetoond cel patronen ondermijnen op een dosis-afhankelijke wijze ^13. Zorg moet worden genomen om te wassen korting op alle resterende fotolak na de fotolithografische proces. Aanhoudende fotolak kan fungeren als een ongewenste cyto-kleeflaag die patroonvorming gedicteerd door parylene-C/SiO ₂ geometrie overschrijft. Aceton is effectief als het gebruik van de fotolithografische bovenstaande proces en met de opgegeven reagentia beschreven. Echter kunnen andere soorten fotoresist een ander oplosmiddel nodig.

Om de impact en het succes van de differe beoordelennt fabricagestappen, kan de contacthoek van de twee contrasterende substraten gemeten. Figuur 2 toont de veranderingen die optreden tijdens de chip activeringsproces. Het is echter waarschijnlijk dat specifieke lijm en afstotende eiwitcomponenten in serum uiteindelijk kan de-paryleen gevormde chip om zijn respectieve cyto lijm of cyto-afstotende eigenschappen uitoefenen.

Alle representatieve resultaten gebruikt chips met een parylene dikte van 100 nm, al hebben we met succes hebben gevormd met behulp van zowel dikker en dunner parylene lagen. Belangrijk is dat deze fotolithografische ets techniek maakt veel grotere driedimensionale bediening van parylene configuratie dan hier afgebeeld. Bijvoorbeeld, een combinatie van fotomaskers, is het mogelijk parylene gebieden gemengde dikte creëren. Dit opent de weg naar het creëren van celculturen met gedefinieerde driedimensionale topografie, die verder gaat dan gewoon dicteren regio's van cel adhesie / repulsie, in potentie een middel voor de integratie microfluïdische kanalen in het construct.

Zoals getoond, maar dit patroon platform niet universeel doeltreffend in celtypen. Verschillende cellijnen, met hun gevarieerde celadhesiemolecuul profielen, niet verwonderlijk anders gedragen wanneer gekweekt op dit platform. We zijn nog niet geïdentificeerd de belangrijkste componenten in het serum, noch de gratis cel-membraan receptoren, die deze cel-patronen platform ondersteunen. Daarvoor in de toekomst belooft het nut en specificiteit te verbreden. Zo kan een "niet-patronen 'cellijn genetisch gemodificeerd worden om de vereiste adhesie molecuul expressie bevorderen en aldus patronen.

Materials

Layout editor software package	e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html		Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture
Bespoke photo mask	e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com		Either fabricate in-house of facilities exist or commision
3" Silicon wafers	e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com
Atmospheric horizontal furnace	e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com		For oxidising silicon wafer
Small spot spectroscopic reflectometer	e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/		To measure depth of silicon dioxide layer
Silane adhesion promoter	e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/	1076730050	Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition
Parylene-C	e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com
SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010	SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/	Model PDS2010
Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter	e.g. SpiChem, www.2spi.com
Automated track system for dispensing photoresist on wafers.	e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track,		Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist.  Pre-bake oven cures the resist.
Photo-resist: Rohm & Haas	Rohm & Haas, www.rohmhaas.com/	SPR350-1.2 positive photo-resist
Phot-mask aligner	e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com
Microchem MF-26A developer	Microchem MF-26A developer, www.microchem.com		Removes exposed reogions of photoresist
Plasma etch system	e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk		Removes exposed regions of parylene
Wafer dicing saw	e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp
Acetone	e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/	A929-4	To wash off residual photoresist
30% Hydrogen Peroxide	e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com	H1009
98% Sulphuric Acid	e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com	435589
Fetal Bovine Serum	Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com	10437	Standard chip activation.
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com	14170