İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli
Summary
Standart yöntemlerle olarak hücreler, fizyolojik bir ortam üzerinden alınır ve bir çanak plastik yüzeyi üzerinde büyütülür. Birincil insan kemik iliği hücrelerinin davranışını incelemek için biz hücreler doku yerel mikro yansıtan koşullar altında yetiştirilen bir 3-D kültür sistemi oluşturulur.
Abstract
Doku kültürü, normal geliştirme hastalığı, hücre fonksiyonunda birçok yönlerini incelemek için paha biçilmez bir araç olmuştur. Geleneksel yöntemler, bir hücre kültürü, doku kültürü çanağı, bir katı alt döküm takmak ya da sıvı bir ortam içinde süspansiyon içinde büyümeye ya da hücrelerin kabiliyetine dayanır. Birden fazla ölümsüz hücre çizgileri birincil hücreler ex vivo büyümüş olması gerekir, ancak, bu yöntemler genellikle başarısız oluşturulur ve bu tür yaklaşımlar kullanılarak büyütülmüştür. Bu başarısızlık plastik doku kültürü, hücre büyümesi için bir yüzey olarak kullanılan standart sistemlerden doku mikro uygun hücre dışı matris bileşenlerinin yokluğunda atfedilmiştir. Hücre dışı matriks doku mikro ayrılmaz bir bileşeni olan ve bunun varlığı, hücre polarizasyon, hayatta kalma ve proliferasyon gibi fizyolojik fonksiyonların korunması için çok önemlidir. Burada bir 3 boyutlu doku kültürü yöntemi primer kemik iliği cel sunmakls, insan kemiği (RBM sistemi) mikro özetlemek için formüle hücre dışı matris içinde büyütülür. Hücre dışı matris içinde gömülü hücreler, böylece birincil dokusunun hücresel bileşimi korurken, hücre hayatta kalması ve çoğalması kadar 30 gün boyunca sürekli olabilir kapsamlı bir sistem sağlamaktadır, insan plazması ile desteklenmiş ortam boyunca besin ile temin edilmektedir. RBM sistemi kullanarak başarıyla normal donörlerin ve hastaların amiloidoz ile, ve çeşitli hematolojik maligniteler primer kemik iliği hücrelerini büyüdü. RBM sistemi yeni terapötiklerin klinik öncesi etki hücre davranış ve değerlendirme doğrudan, in-matris gerçek zamanlı görüntülenmesi için izin verir. Ayrıca, hücreler RBM izole edilir ve daha sonra in vivo nakli, hücre sıralama, akış sitometrisi, ve nükleik asit ve protein analizi için kullanılabilir. Birlikte ele alındığında, RBM yöntem primer kemik Marro büyümesi için güvenilir bir sistem sağlarfizyolojik koşullar altında w hücreleri.
Introduction
Doku kültürü dokunulmamış organizmalar çeşitli işlemleri karşılaştırırken sistemik değişkenliği en aza indirmek için, bir kontrollü bir ortamda hücre davranışını incelemek için geliştirilmiştir. Bu yöntem, ilk olarak 1900'lerin başında 1,2 kurulan ve doku eksplantlar bir cam tabak içinde ex vivo kültürlenmiş bir teknik anlamına gelir edildi. 1900'lü yılların ortalarında sistem oldukça sağlam dokuların parçaları daha dağınık hücreleri büyümek için uyarlanmış ve terimleri 'doku kültürü' ve 'hücre kültürü' 3 eşanlamlı oldu. Bu tür geleneksel hücre kültürü sistemlerinde çeşitli hücre büyüme faktörü ile desteklenmiş büyüme ortamı ile kaplanmış doku kültür plastiğin yüzeyi üzerinde yetiştirilir. Yapışık hücre kültürü, hücre eklemek ve hücrelerin süspansiyon içinde yayılır doku kültürü plastik ve yapışkan olmayan kültürleri, yayılmış: kültürler iki tip çeşitli hücre yapışma kapasitesine göre ortaya çıkmıştır. Hücrenin ilk günlerinden beriKültür, çok ölümsüz hücre çizgileri örneğin HeLa 4, ilk insan kanser hücre çizgisi olarak, yaratılmıştır. Bu hücre hatları, hücre kültürü içinde süresiz olarak çoğalma kapasitesine sahip ve en canlılığını korumak için özel bir muamele gerekmez.
Orijinal hücre kültürü yöntemleri indirgemeci yaklaşım, hücre canlılığı ve çoğalmasını sürdürmek için gereken minimum bileşenleri içerecek şekilde mümkün olduğu kadar sistem basitleştirmek için tasarlanmıştır. Ancak, basitleştirilmiş hücre kültürü yaklaşımlar sonlu ömrü ile ex vivo en temel insan hücre tiplerini desteklemek için başarısız. Bu nedenle, yeni bir kültür sistemleri böylece hücre eksplantlan fizyolojik koşullar altında büyümeye izin, mümkün olduğunca yakından doku mikroçevreyi yaklaştığı dizayn edilmektedir. Geleneksel / indirgemeci yaklaşımlar hücre kültürü, 3 boyutlu (3-D) aksine kültür sistemleri şimdi çeşitli etkin bir kültür için tercih edilen bir yöntem haline gelmektedirinsan hücre hatları ve primer hücreler daha sonra destekleyici bir mikro-bağlamında, sağlık ve hastalık ile ilgili mekanizmaların çalışılmasına. 3-B sistemleri genellikle ilgi hücre türlerini incelemek için doku mikroçevreyi özetlemek amacıyla, büyüme faktörleri ile takviye yeniden matrisler ve / veya orta kullanılarak ayarlanır. Bu 3-boyutlu (3-D) kültür modellerinin ilk meme bezi gelişimini incelemek için geliştirilmiştir. Meme epitelyal hücreleri, Matrigel gömülü olan yerel koşullar, kollajen IV ve hücre dışı matrisin (ECM) laminin-zengin bir kaynak ile hücre sağlamak ve büyüme ortamı ile kaplanmış için. Bu koşullar altında, meme epitelyum hücreleri meme asinüsü benzeyen kümeleri oluşturulmuş ve laktojenik hormonlar ile uyarılması üzerine, bu acininin acininin benzeri yapıların içi boş LUMENA içine, kazein ve diğer süt proteinleri salgılanır. Kazein salgılama bile prolaktin 5 ilave edildikten sonra standart kültürlerde gözlenmedi, Ayrıca hücrelerin morfolojik ve fenotipik özelliklerini koruyarak mikroçevresinin rolünü vurgulayarak. Hücreler fizyolojik mikroçevresinin bağlam dışına alınır, normal hücresel fonksiyonunun kaybı başka gösteri destekleyici mikro olmaksızın, keratinositler tabakalı epidermis 6 oluşturmak için başarısız bir gösteri. Diğer 3-D modellerin bir dizi birincil hücrelerinin ex vivo yayılmasını 7,8 izin yaratılmıştır.
Hücre davranış mikroçevresinin önemli rolü zarif ben matris zaman kollajen kültüre meme epitel hücreleri Matrigel'de oluşmuştur doğru polarize asinüs göre, "iç-dış" asinüsü oluşan bir çalışmada gösterildi. Laminin üreten miyoepitelial hücreler kolajen I 9 kültürlere ilave edildi zaman uygun morfoloji bu kayıp dönülmüştür. Ayrıca, doğru bir mikro-ortam doğru için gereklidirgenotip tezahürüdür. Bir tabak içinde yetiştirilen, bir hücre-hücre yapışma molekülü ile transfekte CEACAM1 MCF7 meme kanseri hücrelerinin transfekte edilmemiş CEACAM negatif hücreleri ile tam olarak aynı şekilde davranır. Ancak, habis olmayan meme epitel 10 ile kurulmuştur gibi CEACAM1 ile transfekte MCF7 hücreleri, oyuk LUMENA normal bir fenotip ve form asinüs dönmek ise ECM, vahşi tip bir şekilde MCF7 tümör benzeri yapılar ile temas halinde, Matrigel kültürlenmiştir. Benzer şekilde, β1-integrin meme kanseri hücrelerinde engelleme standart kültür koşulları altında davranışlarını değiştirmek, ancak 3-D kültürde gerçekleştirilen aynı deney β1-integrin bloke normal bir fenotip 11 malign hücrelerin döner göstermektedir etmez. Bu nedenle, yalnızca doku mikro çevre hücre canlılığını korumak için gerekli değildir, ancak, aynı zamanda, uygun hücre fonksiyonunu korumak için.
Hücre davranış, fizyolojik koşullar altında incelenebilir bir sistem sağlamaya ek olaraks, 3-B kültürleri yeni terapötik 8,12,13 klinik öncesi testleri için olduğu gibi sağlam ve güvenilir orta çalışır. 3-B hücrelerinin kültürlenmesi hücre-hücre ve hücre-ECM yapışmasının katkı değerlendirilebilir çevre aracılığında ilaç direnci 14, koşullarında araştırma bileşiklerin tarama sağlar. Bundan başka, yeni bileşimlerin hedef dışı toksisite çeşitli dokuların birden fazla hücre bölmeleri dahil edilmesi ile tespit edilebilir. Bu tür taramalar daha hızlı gerçekleştirilir ve daha düşük maliyetli bir in vivo 8 karşılaştırılabilir çalışmalara göre girmektedir.
Burada normal ve habis kemik iliği (BM) hücreleri yakından insan BM mikro taklit eden bir sistem içinde ex vivo çoğalan yeniden kemik iliği (RBM) bir 3-D modeli bir kurulum mevcut. BM stroma çeşitli bileşenleri ile 2-B kültürler, sıvı ya da yapışkan cocultures primer insan BM hücrelerinin büyüyen bir önceki girişimlerVeya 3-D, yarı katı agar kültürleri nedeniyle doku mikro 15-18 bileşenleri ile hücre kaynağı kendi yetersizlik sınırlı başarı ile bir araya geldi. Bu sistemlerde birincil BM hücreler kötü canlılığı vardı ve ex vivo çoğalırlar başarısız oldu. İnsan BM progenitör hücrelerin BM stromal hücreleri ile küremsi cocultures yetiştirilen bir başka sistem hematopoetik kök hücre canlılığı ve proliferasyonu, en az 96 saat 19 için sürekli bir 3-D sistemidir. Hematopoietik progenitör biyoloji anlaşılması için son derece faydalı olmasına rağmen, ancak, bu sistem sadık yararlılığını sınırlama, bu nedenle ECM bileşenlerinin bulunmaması nedeniyle DM'nin mikro özetlemek değildir. Burada açıklanan model, insan RBM DM'nin hem hücresel hem de hücre dışı bölme in vitro yeniden inşa edilir kapsamlı bir sistem sunar. Biz RBM kültürleri, normal insan BM hücrelerinin ex vivo büyümesini desteklemek olduğunu göstermektedir bizçeşitli hematolojik hastalıkları olan hastalardan izole edilen hücreler olarak Ll.
Protocol
Representative Results
Discussion
RBM modeli BM hücresel kompozisyonu kadar 30 gün boyunca ex vivo korunur kapsamlı bir sistem sağlar. Onların fonksiyonu yakından in vivo bulunan BM mimarisini taklit göre RBM kendini katmanlaştırma yetişen BM hücreler. Ayrıca, bu çoklu miyelom klon 8 genişlemesi için izin veren ilk sistemdir. BM hücrelerinin güçlü büyüme ve kültür genel başarı sağlanması için en önemli adımlar şunlardır: 1)>% 70 canlılığı ve kırmızı kan hücreleri daha çok serbest i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Sağlık Bakanlığı, Ulusal Kanser Enstitüsü (1R21CA141039), BD Biosciences Araştırma Bursu Ödülü, Kanser için Purdue University Center Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu (IRG # 58-006-53), Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe tarafından finanse edildi Araştırma ve Sağlık Araştırma ve Alberta Kanser Araştırma Kurulu Girişimleri Programı Kanada Enstitüleri. MP Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü, Kanser Önleme Staj Programı tarafından desteklenmiştir (R25CA128770; PI: D. Teegarden) Onkolojik Bilimler Merkezi ve Purdue Üniversitesi Discovery Öğrenme Araştırma Merkezi tarafından yönetilmektedir.
Materials
| CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry | Invitrogen/Life technologies | C34554 | |
| Fibronectin from human plasma | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Rat tail collagen type I | BD Biosciences | 354249 | Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol |
| Vectashield mounting medium for fluorescence (regular set) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets | Sigma-Aldrich | F4648 | For TRAP staining |
| SigmaFast BCIP/NBT tablets | Sigma-Aldrich | B5655 | For alkaline phosphatase staining |
| Zeiss confocal LSM 510 microscope | Carl Zeiss | ||
| Zeiss 510 software | Carl Zeiss | Image analysis software for confocal analysis | |
| Zeiss Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Image analysis software for Axiovert 200M | |
| FACSort flow cytometer | BD biosciences | ||
| CellQuest Pro software | BD biosciences | Software for the analysis of flow cytometry data |
References
- Carrel, A. On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism. J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).
- Harrison, R. G. Observations on the living developing nerve fiber. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).
- Earle, W. R. Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).
- Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium. Cancer Res. 12, 264-265 (1952).
- Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane. Development. 105, 223-227 (1989).
- Lamb, R., Ambler, C. A. Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model. PloS One. 8, (2013).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion. Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).
- Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Gunn, E. J., et al. The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma. Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).
- Hsiao, A. Y., et al. 384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids. Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).
- Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease. Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).
- Golde, D. W., Cline, M. J. Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture. Blood. 41, 45-57 (1973).
- Gartner, S., Kaplan, H. S. Long-Term Culture of Human-Bone Marrow-Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. Biol. 77, 4756-4759 (1980).
- Caligaris-Cappio, F., et al. Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma. Blood. 77, 2688-2693 (1991).
- Pike, B. L., Robinson, W. A. Human bone marrow colony growth in agar-gel. J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).
- Bug, G., et al. Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells. J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, (2006).
- Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance. J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).
