Un tejido tridimensional Cultura modelo para estudiar primaria médula ósea humana y sus malignidades

Summary

En los métodos de cultivo estándar se toman células de su entorno fisiológico y se hicieron crecer en la superficie de plástico de un plato. Para estudiar el comportamiento de las células de médula ósea humana primaria hemos creado un sistema de cultivo de 3-D, donde las células se cultivan en condiciones que recapitulan el microambiente nativo del tejido.

Abstract

El cultivo de tejidos ha sido una herramienta muy valiosa para estudiar muchos aspectos de la función celular, desde el desarrollo normal a la enfermedad. Métodos de cultivo celular convencionales se basan en la capacidad de las células ya sea para unirse a un sustrato sólido de una placa de cultivo de tejido o para crecer en suspensión en medio líquido. Múltiples líneas celulares inmortales se han creado y crecido utilizando estos enfoques, sin embargo, estos métodos a menudo fallan cuando las células primarias necesitan ser cultivadas ex vivo. Dicha avería se ha atribuido a la ausencia de los componentes de la matriz extracelular apropiadas del microambiente del tejido de los sistemas estándar que se utiliza plástico de cultivo de tejidos como una superficie para el crecimiento celular. La matriz extracelular es un componente integral del microambiente del tejido y su presencia es crucial para el mantenimiento de las funciones fisiológicas tales como la polarización celular, la supervivencia y la proliferación. Aquí presentamos un método de cultivo de tejidos de 3 dimensiones donde cel hueso medular primariaLS se cultivan en matriz extracelular formulado para recapitular el microambiente de la médula humana (sistema de RBM). Incrustado en la matriz extracelular, las células se suministran con nutrientes a través del medio suplementado con plasma humano, proporcionando así un sistema integral donde la supervivencia y la proliferación celular se puede mantener durante hasta 30 días, mientras que el mantenimiento de la composición celular del tejido primario. Usando el sistema de gestión por resultados que hemos crecido con éxito células de médula ósea primarias de donantes sanos y en pacientes con amiloidosis, y diversas neoplasias hematológicas. El sistema de GBR permite, visualización directa en-matriz en tiempo real del comportamiento celular y evaluación de la eficacia preclínica de nuevas terapias. Por otra parte, las células se pueden aislar de la GBR y posteriormente utilizados para el trasplante in vivo, clasificación de células, citometría de flujo, y el ácido nucleico y el análisis de proteínas. En su conjunto, el método de gestión por resultados proporciona un sistema fiable para el crecimiento de huesos primario marrocélulas W en condiciones fisiológicas.

Introduction

El cultivo de tejidos se ha desarrollado para estudiar el comportamiento de células en un entorno controlado para minimizar la variabilidad sistémica cuando la comparación de diversos procesos en organismos intactos. Este método se estableció por primera vez en el 1900 y ^1,2 se refiere a una técnica en explantes de tejidos fueron cultivadas ex vivo en un plato de cristal. A mediados de la década de 1900 el sistema fue adaptado para hacer crecer células dispersas en lugar de fragmentos de tejidos intactos, y los términos "cultivo de tejidos" y "cultivo celular" se convirtió en sinónimo de ^3. En tales sistemas de cultivo celular convencionales células se cultivan en la superficie del plástico de cultivo de tejidos superpuestos con medio de crecimiento suplementado con varios factores de crecimiento. Dos tipos de culturas han surgido sobre la base de la capacidad de adhesión de varias células: cultivo de células adherentes, donde las células se adhieren y propagan en el plástico de cultivo de tejidos y cultivos no adherentes, donde las células se propagan en suspensión. Desde los primeros días de la célulaSe han creado de cultivo, múltiples líneas de células inmortales, tales como células HeLa ^4, la primera línea celular de cáncer humano. Estas líneas celulares tienen la capacidad de proliferar indefinidamente en cultivo celular, y la mayoría no requiere ningún tratamiento especial para mantener la viabilidad.

El enfoque reduccionista de los métodos de cultivo de células original fue diseñado para simplificar el sistema tanto como sea posible mediante la inclusión de sólo los componentes mínimo requerido para mantener la viabilidad celular y la proliferación. Sin embargo, los enfoques de cultivo celular simplificados no apoyan ex vivo la mayoría de los tipos de células humanas primarias con finito vida útil. Por lo tanto, los nuevos sistemas de cultivo están siendo diseñados para aproximar el microambiente del tejido lo más estrechamente posible, permitiendo así que los explantes de células para crecer en condiciones fisiológicas. En contraste con los enfoques de cultivo celular convencionales / reduccionistas, 3 dimensiones (3-D) sistemas de cultivo se están convirtiendo en un método preferido para la cultura de manera eficiente varioslíneas celulares humanas y células primarias para estudiar posteriormente los mecanismos implicados en la salud y la enfermedad, en el contexto de un microambiente de apoyo. Tales sistemas de 3-D se instalan generalmente usando matrices y / o reconstruidos medio suplementado con factores de crecimiento, con el fin de recapitular el microambiente del tejido para estudiar los tipos de células de interés. La primera de estas 3 dimensiones (3-D) modelos de cultivo fue desarrollado para estudiar el desarrollo de la glándula mamaria. Para proporcionar las células con condiciones nativas células epiteliales mamarias fueron incrustados en Matrigel, colágeno IV y laminina-fuente rica de la matriz extracelular (ECM), y sobrepuesto con medio de crecimiento. Bajo tales condiciones, las células epiteliales mamarias forman racimos se asemejan a los acinos mamaria, y a la estimulación con hormonas lactogénicas, estos acinos secretadas caseína, y otras proteínas de la leche, en el hueco lúmenes de las estructuras-acinos similares. La secreción de caseína no se observó en los cultivos estándar, incluso después de la adición de prolactina ⁵, Enfatizando el papel de microambiente en la preservación de las características morfológicas y fenotípicas de las células. Otra demostración de la pérdida de la función celular normal cuando se toman células fuera del contexto de su microambiente fisiológica es una demostración de que sin microambiente de apoyo, los queratinocitos no pueden formar epidermis estratificada ^6. Un número de otros modelos en 3-D han sido creados para permitir la propagación ex vivo de células primarias ^7,8.

El papel crucial de la microambiente en el comportamiento de las células se demostró con elegancia en un estudio en el que las células epiteliales mamarias forman "dentro-fuera" acinos cuando se cultiva en el colágeno I de la matriz, en comparación con los acinos polarizado correctamente que se formó en Matrigel. Esta pérdida de la morfología adecuada se revirtió cuando se añadieron las células mioepiteliales laminina productoras a las culturas de colágeno I ^9. Por otra parte, se requiere microambiente adecuado para la exactamanifestación genotipo. Se cultiva en un plato, las células de cáncer de mama MCF7 transfectadas con una molécula de adhesión célula-célula CEACAM1 se comportan exactamente igual que las células negativas CEACAM no transfectadas. Sin embargo, cuando se cultivan en Matrigel, en contacto con ECM, forma MCF7 wildtype estructuras de tipo tumoral, mientras que las células MCF7 transfectadas con CEACAM1 revertir a un fenotipo y la forma acinos normal con lúmenes hueco, como se ha establecido con el epitelio mamario maligno ^10. Del mismo modo, el bloqueo de β1-integrina en las células de cáncer de mama no cambia su comportamiento bajo condiciones de cultivo estándar, pero el mismo experimento llevado a cabo en cultivos de 3-D demuestra que el bloqueo de β1-integrina vuelve células malignas a un fenotipo normal ^11. Por lo tanto, microambiente del tejido no sólo es necesaria para mantener la viabilidad celular, sino también para retener la función apropiada de la célula.

Además de proporcionar un sistema en el comportamiento de la célula puede ser estudiado bajo condiciones fisiológicass, culturas 3-D función de medio tan robusto y fiable para la prueba preclínica de nuevas terapias ^8,12,13. El cultivo de las células en 3-D permite el cribado de compuestos en investigación en las condiciones de medio ambiente mediada por resistencia a las drogas ^14, donde la contribución de célula-célula y célula-ECM adherencia puede ser evaluada. Además, fuera del objetivo toxicidad de nuevos compuestos puede determinarse mediante la incorporación de múltiples compartimentos celulares de diversos tejidos. Estas pantallas se pueden realizar más rápidamente y son más rentables que los de los estudios comparables en vivo ^8.

Aquí les presentamos una configuración de un modelo 3-D de la médula ósea reconstruida (RBM), donde las células de la médula ósea normal y maligno (BM) proliferan ex vivo en un sistema que imita muy de cerca el microambiente de la BM humano. Los intentos previos de cultivo de células primarias BM humanos en cultivos de 2-D, líquido o co-cultivos adherentes con diversos componentes de la BM estromaO 3-D, cultivos de agar semi-sólidos han tenido un éxito limitado debido a su incapacidad para abastecer las células con los componentes del microambiente del tejido ^15-18. En estos sistemas de células primarias de BM tenían escasa viabilidad y no lograron proliferar ex vivo. Otro sistema donde las células progenitoras BM humanos se cultivan en co-cultivos de esferoides con células estromales de BM es un sistema de 3-D que se sufrió la viabilidad de células madre hematopoyéticas y la proliferación durante al menos 96 h ^19. Sin embargo, aunque altamente beneficioso para la comprensión de la biología progenitoras hematopoyéticas, este sistema no recapitula fielmente el microambiente de la BM debido a la ausencia de componentes de ECM, por lo tanto, limitando su utilidad. El modelo de gestión por resultados descritos aquí presenta un sistema integral donde ambos compartimentos celulares y extracelulares del BM humana se reconstruyen in vitro. Se demuestra que las culturas de gestión por resultados pueden apoyar el crecimiento ex vivo de las células BM humanos normales, como hemosLL como células aisladas de pacientes con diversos trastornos hematológicos.

Protocol

1. Anticipo para la Preparación Mantenga pipetas serológicas estériles y puntas de pipeta a 4 ° C. Solución de problemas: geles de Matrigel a temperatura ambiente (RT); utilizando pipetas fríos y consejos evitarán Matrigel gelifique durante la configuración de la cultura. Descongelar una botella de Matrigel en 4 ° C durante la noche. 2. Preparación de los reactivos Preparación de la solución de fibronectina existencia:…

Representative Results

Dado que las células de médula ósea primaria fallan a proliferar en condiciones de cultivo de tejidos estándar, el sistema de GBR se ha creado para imitar el microambiente de la médula, proporcionando un sistema para la cultura y expandir las células BM ex vivo. Los principales componentes de la matriz extracelular BM, fibronectina, colágeno I, colágeno IV, laminina y 21, se incorporaron a la matriz RBM para proporcionar el andamiaje estructural de esta cultura 3-D. Endostio, la interfaz entr…

Discussion

El modelo de gestión por resultados proporciona un sistema integral donde la composición celular del BM se mantiene ex vivo por hasta 30 días. BM células cultivadas en la auto-estratificar RBM según su función imitando de cerca la arquitectura BM encontrado in vivo. Por otra parte, este es el primer sistema que permite la expansión del clon mieloma múltiple ^8. Los pasos más importantes para garantizar el sólido crecimiento de las células de BM y el éxito general de la cultura son…

Materials

CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry	Invitrogen/Life technologies	C34554
Fibronectin from human plasma	Millipore	NG1884448
Ficoll-Paque PLUS	GE Lifesciences	17-1440-02
Matrigel basement membrane matrix	BD Biosciences	354234
Rat tail collagen type I	BD Biosciences	354249	Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol
Vectashield mounting medium for fluorescence (regular set)	Vector Laboratories	H-1000
SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets	Sigma-Aldrich	F4648	For TRAP staining
SigmaFast BCIP/NBT tablets	Sigma-Aldrich	B5655	For alkaline phosphatase staining
Zeiss confocal LSM 510 microscope	Carl Zeiss
Zeiss 510 software	Carl Zeiss		Image analysis software for confocal analysis
Zeiss Axiovert 200M inverted microscope	Carl Zeiss
MetaMorph software	Molecular Devices		Image analysis software for Axiovert 200M
FACSort flow cytometer	BD biosciences
CellQuest Pro software	BD biosciences		Software for the analysis of flow cytometry data