生理フローの状況の下で循環細胞のケモカイン指向溢出を研究する新規三次元フローチャンバーデバイス

Summary

三次元流れチャンバ装置は、新規である

Abstract

血流から細胞を循環の血管外遊出は、幹細胞ホーミング及び腫瘍転移を含む多くの生理学的および病態生理学的プロセスにおいて中心的な役割を果たしている。三次元フローチャンバー装置（以下、3Dデバイス）が生理的せん断応力を再作成し、細胞溢出カスケードの各ステップを定量化することができるインビトロ技術における新規である。 3Dデバイスは、目的の細胞はせん断応力下で循環する上部コンパートメント、および利息の化学誘引物質が含まれている静的な井戸の下部コンパートメントで構成されています。二つの区画は、内皮細胞（EC）の単層で被覆された多孔質インサートによって分離されている。関心の微小環境の細胞とオプションの二番目の挿入は、EC層の直下に配置することができます。ガス交換部は、最適なCO ₂の張力を維持することができ、中に細胞または化合物を加えるか、または撤回するアクセスポイントを提供実験。試験細胞は、蠕動ポンプによって制御される所望のせん断応力（流量）上部コンパートメントに循環する。実験の最後に、循環移動した細胞を、さらなる分析のために収集される。 3D装置は、ケモカイン勾配、せん断応力に対する抵抗、クラスター形成、及び細胞生存に応じてせん断応力、遊出の下ECへと転動および接着細胞を検査するために使用することができる。また、任意の第2のインサートは、ECと微小環境セル間のクロストークの影響を検討することができる。 3Dデバイスの並進アプリケーションは医薬品候補のテストが含まれている標的細胞の遊走および静脈内注射後の細胞の生体内挙動を予測する。このように、小説の3Dデバイスは、セルラー溢出を仲介する分子メカニズムを研究するための汎用性と安価なツールです。

Introduction

細胞の血管外漏出は循環細胞が血流を終了して、体内の多くの生理学的応答の重要なコンポーネントであるプロセスである。プロセスは、例えばとして、組織再生のためにも重要である、血管（または静脈注射）に組織から動員治療細胞が血管系を通って移動し、けがや変性の部位に循環を終了するとき。血管外漏出は、炎症、免疫拒絶反応、自己免疫、および腫瘍転移を含む多くの疾患の病因の重要なコンポーネントです。

血管外漏出は、生理的流れの条件下での内皮細胞（EC）との循環細胞の相互作用を含む複雑な多段階のプロセスです。工程（）は、細胞ローリング、ECの管腔表面に（b）の密着性、及びEC横切って（c）の遊出を備える。重要なことは、溢出カスケードの各ステップを、cのサブセットによって調節されるエル型特異と種特異的分子。ただし、特定の細胞サブセットの血管外漏出を規制する詳細な分子メカニズムはよく主因血流中の条件をrecapitulatingの技術的な難しさには、理解されていない。ここで説明する新規な3D装置は、これらの技術的課題を克服し、実験は細胞遊走の生物学の理解を改善することを実行するように設計されている。

細胞移動を仲介する分子は、重要な治療標的である。特定の種類の細胞遊走を制御する分子事象の詳細な理解は、血管外漏出の治療推進または抑制のための新たな目標を特定するのに役立ちます。例えば、けがや変性のサイトに向けて治療幹細胞の遊走を（、大人新生児あるいはから胎児組織由来かどうか）を高める介入は組織再生に大きな効用であろう。多能性供給源に由来する細胞を含む治療用幹細胞のインビトロ生成およびエクスビボ操作成体幹細胞（膨張遺伝子操作された、様々な酵素前処理された^）1において関心が高まっている。従って、それらは治療目的のために使用される前に、幹細胞の品質を評価するための新規な技術が必要とされている。他のパラメータの中で、細胞が多疾患の治療は²幹細胞の静脈内投与が必要な場合がありますので、効率的に循環を終了することができなければなりません。実際に、幹細胞生物学における現在の課題の一つは、非常に低い効率を克服することである組織の損傷^3-6の部位に幹細胞は家庭、幹細胞の遊走の理解では、このギャップに対処する必要性を強調している。対照的に、特定の戦略ホーミング分子を標的とすることブロック細胞遊走ラーニングの治療のために有用であること炎症や自己免疫疾患と同様、転移癌。したがって、細胞遊走及び血管外漏出の間を循環する細胞とECとの間の相互作用を仲介する分子機構を理解することはトランスレーショナル医学と創薬へのと同様、基礎科学に関連しています。

細胞移動のさまざまな側面を研究するために利用可能な方法の数は現在ありません。しかし、これらの方法は、新しい3Dデバイスに克服することができる欠点を有する。

動物モデル：

このような免疫不全マウスと遺伝子操作マウスなどの動物モデルは、 生体内でのヒト細胞の遊走を研究するための有用なツールとなっている。しかしながら、これらのモデルへの1つの重要な欠点は、ヒト細胞は、多くの細胞表面分子中の種特異的配列の相違に起因する部分に、マウスEC上に存在する接着分子との相互作用が不十分である。このように、げっ歯類の使用は勉強するヒト細胞遊走は、本物の人間の臓器特異的血管床内のイベントを反映しにくい。加えて、in vivoモデルにおける薬物候補のハイスループットスクリーニングには適していない。ホーミング細胞を研究するために用いたin vivoモデルで 、従来のは、それが困難な小説ホーミング分子を同定し、標的とすること、血管外漏出カスケードの異なる段階を区別しません。生体顕微鏡アプローチは、この必要性に対処するために開発され、有益であったが、この技術は、非常に時間と労力が^7,8である。

静的転生アッセイ：

多孔質膜を横切るトランスウェル又はボイデンチャンバーアッセイを測定する細胞遊走、広くマイグレーション試験で使用されている。このアッセイは、細胞の遊走ケモカイン媒介性もそれが細胞の運動性および細胞外マトリックス（ECM）の相互作用だけでなく、研究するために使用することができるという利点を有するが、EC単層全体に多孔性膜上に成長した。残念なことに、静的な条件下での表現型とECの機能が生理的流れ^9,10下のものとは大きく異なる。したがって、トランスウェルアッセイで発生走イベントは忠実にせん断応力下での遊走細胞とECとの間の相互作用を模倣していない。また、全体的なプロセスへの選択の余分な次元を追加ホーミングカスケードの "ローリング"のステップでは、静的なトランスウェルアッセイでは発生しません。この技術はEC単層を横切っケモカイン媒介性細胞遊走を定量的に評価することができないしつつ、それは生体内の血流を模倣するせん断応力を提供することができないことによって制限される。

せん断応力下でのアッセイ：

壁せん断応力は、EC機能^9,10の調節に重要な役割を果たすことが知られている。せん断力は、シグナリングカスケードの急速な活性化、transcを誘発ription因子およびEC ^11,12の差動遺伝子発現。接着アッセイの次世代の開発につながっこの情報-並列層流チャンバーと毛細血管-せん断応力^7,13条件下でECに対する細胞のローリングと接着を研究する。これらのアッセイのための制限要因は、彼らが唯一のローリングと接着測定できるということですが、転生するために行くだろう接着細胞およびEC単層の "逮捕"され、転生しないであろう接着細胞を区別しません。さらに、これらのアッセイは、ケモカイン勾配に向かって細胞の移動を測定することはできません。

いくつかの報告は、流れ¹⁴の条件下で、ガラススライド上で増殖させEC単層の下にクロールする付着細胞の能力を記載している。このクロール手法には限界があります：それは、細胞の数は限られて分析し、それは非定量的であり、それは、行列とセルにクロール細胞を分析lの表面ではなく、走勾配に向かって移行、そしてそれは転生の細胞を単離することはできません。このアッセイは、EC単層にせん断応力を印加するという利点を有するものの、したがって、それはケモカイン勾配に向かって細胞の遊走を定量化することはできない。

ここで説明する新規な3D技術は、静的なケモカイン勾配（下部室）でせん断力（上側の区画）を組み合わせることによって、これらの欠点の多くを克服し、血管外遊出カスケード（ 図1）の各工程の定量的評価を可能にする。装置は、EC及び微小環境との間のクロストークが循環細胞の血管外遊出をサポートするために、ECの能力に影響を与える方法を調査するために使用することができる。以下のプロトコールは、3Dフローチャンバー装置を使用するためのステップ·バイ·ステップ法を記載している。

Protocol

1。コラーゲンコーティングによる細胞増殖の上限と下限インサートを準備

1. 実験に必要とされる挿入の数を計算します。独立した滅菌ペトリ皿（35×10mm）で、各インサートを置き、照射（11 Gyの）で滅菌する。
2. 50μgの/ mlで、挿入当たり154μlの（表面積1.54センチメートル^2を挿入）：膜のコーティングのためのコラーゲン溶液を準備します。
3. インサート膜の表面に、サークル内のコラーゲン溶液を数滴（ドロップあたり〜20μL）を配置（ピペットチップが表面に触れないでください）​​してから、慎重に上の1つの大粒を形成するアリコートの残りの部分を追加膜表面。コラーゲン溶液は、半球状のままであり、膜表面から排出しないことを確認してください。
4. 蓋付きのペトリ皿をカバーし、平らな面に室温で1時間インキュベートする。
5. コラーゲン溶液を吸引し、160μlのPBSで覆うことにより、一度膜を洗う。
6. ASPIRATE PBSと蓋を交換してください。同じ日を使用している場合は、室温で乾燥した場所にペトリ皿を置きます。それ以外の場合は、4℃でお皿を置き、7日以内に、インサートを使用しています。

2。アッパー挿入で培養内皮細胞

1. 希望の培地でEC懸濁液を準備します。細胞生存率は> 98％であることを確認し、すぐに使用しています。

注：ヒト臍帯静脈EC（HUVEC）の場合、4×10 ⁵細胞挿入あたり160μlの中に使用されます。

2. セクション1で調製したコラーゲンコートインサート付きペトリ皿を取る;皿からの挿入を削除しないでください。コラーゲンコート膜（ピペットチップタッチの表面を聞かせていない）の表面上の円の中に細胞懸濁液（ドロップあたり約20μl）をいくつかの小滴を置き、その後慎重に形成するために細胞懸濁液の残りの部分を追加1大粒。細胞懸濁液がHemisのままであることを確認してください phericalと膜表面から排出されません。
3. 蓋を交換して、慎重に細胞が膜に付着することができるように30分間37℃で（動揺なし）5％CO ₂細胞培養インキュベーターとインキュベートで皿を置きます。
4. 穏やかにインサートが皿の底に残り、完全に媒体によって覆われることを確実に各シャーレに培養培地5mlを加える。蓋を交換して、慎重にインキュベーターに戻って料理を置く。 37℃で一晩培養細胞。
5. EC層を含むインサートの下に配置される局所微小環境を表す細胞と2番目（オプション）の下の挿入を準備するために、同じ方法を使用します。

注：下部インサートは実験に含まれている場合、上下のインサートが第1の3D装置（ 図4B）への挿入を配置する前に互いに接続されている。

E "> 3。3Dフローチャンバー装置を組み立てる

1. 、上部と下部のプレートを一緒にねじ込みチューブを使用してガス交換ユニットにプレートを接続する、きれいなビニール袋に組み立て装置を配置し、照射によるバッグと中身（11 Gyの）を殺菌する。
2. 70％エタノールで滅菌組織培養フード、スプレーに細胞培養インキュベーター、場所からトレイ棚を外し、拭き取り、その後大型無菌ナプキンでトレイをカバーしています。
3. フードに照射ビニール袋を置き、滅菌インキュベータートレイに袋と場所からデバイスを削除する。提供チューブと蠕動ポンプにデバイスを接続します。 0.2ミリリットル/分の最適な速度のためのプログラムのポンプ。

注：電気ソケットにポンプを接続するには、インキュベーターの裏側の穴に電気コードを押し出す。穴が気密であることを保証するために、コードの周り強盗のプラグを使用してください。

4。首相3Dフローチャンバーデバイス

1. チューブ（チューブの無菌性を維持するために、小さな無菌ナプキンを使用してください）​​から、金属針を引っ張ってコンセントからインレットチューブを外します。 "入口"と "アウトレット"としてチューブの切断端とチューブに接続された金属針を使用してください。メディアとを15mlチューブに金属針入口を置き、空を15mlチューブにコンセントを配置します。
2. フローを0.2 ml /分で反時計回りに、流量設定されているので、ポンプの電源をオンにします。チューブ内を15ml入口管から媒体を描画し、それが装置（ 図2、ストップ＃1）に接続する前に媒体を直ちにチューブの端部に到達したときに、ポンプを停止させる負圧を可能にする。
3. ネジを外し、装置の上部及び下部プレート。メディの1,550μlの - 慎重に上部プレートと場所1500を削除下のウェルに（培地のみまたはプラス実験ケモカインのいずれか）ええと。下板上記2ミリメートル - まあ、約1に到達した半球を形成するのに十分なメディアが含まれていることを確認してください。
4. 全く気泡が挿入下に閉じ込められていないことを確認しながら、シャーレから無菌ピンセットを用いて下部プレートのウェルに準備し、インサートを転送します。プレートはドライのままことを保証するために下部プレートの表面に表示されるあらゆる媒体を吸引。下板に上板バックを置き、ネジを使用して再接続プレート。
5. 直ちに蠕動ポンプをオンにし、媒体が3Dデバイスを介して流れるように。装置の出口端部を上昇し、プレート間の空間内での気泡の形成を防止するために、この位置においてチャンバを維持する。
6. 媒体はガス交換ユニットにチャンバーを接続室とチューブを埋めることができます。媒体は、ガス電子到達する直前に、ポンプを停止させるXchangeのユニット（ 図2;ストップ＃2）。 、ガス交換ユニットに培地3mlを置きポンプをオンにし、気泡がガス交換ユニットを介して脱出することができます。アウトレットチューブ（ 図2、ストップ＃3）の端より3センチメートル-媒体が2に達したときに媒体がガス交換ユニットを終了チューブを記入し、ポンプを停止できるようにガス交換ユニットを高める。
7. 小さな無菌ナプキンを使用してコンセントに入口金属針を接続します。それらはガス交換部に達すると媒体ガス交換部に向かって反対方向に流れ（時計回り）とは、任意の気泡が除去されることを確認できるよう、ポンプを再プログラム。気泡がシステムに残っていないことを確認してください。
8. 媒体が反時計回りに流れるようにポンプを再プログラム。ガス交換ユニットにテスト細胞懸濁液を100μlを加える。ガス交換ユニットの蓋を閉め、インキュベーターに作業システムの背面にトレイを置き、試験細胞がcirculatすることができます希望の時間のために37℃で3次元デバイスにおけるe。

注意：70％エタノールでポンプの電気コードをきれいにし、インキュベーターの中に置きます。

5。テストを終了し、アッセイのためのサンプルを収集

1. インキュベーターとフード内の場所から作業システムとトレイを取り外します。ポンプを停止し、入口と出口を外し、空の滅菌を15mlチューブに端を置きます。
2. 適切な場合に使用するまで、氷上に場所細胞懸濁液を、ポンプの電源を入れ、システムからの細胞懸濁液を収集します。
3. ネジを取り外し、上部プレートを持ち上げてチャンバーを分解します。下板からインサートを外し、ペトリ皿に移す。

注：インサートはその場で細胞を可視化し、カウントする染色（クリスタルバイオレットのdH ₂ Oで0.05％）またはそれ以上のためのECを収集するためにトリプシン処理することができますテスト。

4. 培地および下段のウェルから細胞をチューブにして210×gで5分間遠心を削除します。 、上清を除去洗浄し、必要に応じて細胞を再懸濁し、そして具体的な実験の目的（さらに後述）に従って細胞を処理します。

Representative Results

マウス骨髄由来のECラインSTR-12が5μmの細孔を有するインサート上で成長させた。 ECの成長速度は、顕微鏡下でモニターし、ECが100％コンフルエントであった場合に、インサートは、3Dデバイスの下部区画にウェルに移した。すぐにインサートを配置する前に、下部室のウェルは、単独で培地（陰性対照）または間質細胞由来因子-1（図5 ngの/ ml及び50 ngの/ mlのSDF-1）を添加した培地で満たした。その後、3D装置を組み立てたとプロトコルに記載されているようにチャンバを培地で満たした。装置の上部室に循環するテストセルが新たにマウス骨髄細胞（チャンバ当たり3.5×10 ⁶細胞）を回収した。 0.8ダイン/ cm ²で定義された剪断応力を0.2 ml /分で、蠕動ポンプ速度を設定することにより塗布した。全体の作業システムは、次いで、37℃、セリウム、5％CO ₂インキュベーターに入れたLLSは、4時間のEC単層と循環と相互作用することが許された。その時間の終わりに、循環細胞を回収し、チャンバを分解し、プロトコルに記載されているようにインサートを除去した。転生細胞を新鮮な培地に再懸濁し洗浄低級ウェルから回収し、コロニー形成細胞（CFC）アッセイ（ 図3）造血成長因子を補充メチルセルロース培養物に移した。期待通りに、我々は、CFCの有意に高い数は一人で5 ngの/ mlのSDF-1または培地を含有するウェルにより50 ngの/ mlのSDF-1を含むウェルにEC単層全体に移行していたが見つかりました。

我々は前述のように、細胞遊走を研究するために利用可能インビトロ技術における電流のいずれも移動細胞の血管外遊出をサポートするために、ECの能力に局所微小環境の影響を試験することができるありません。これは、3Dデバイスで達成することができる方法を説明するために、我々ECの層および骨髄間質細胞の層を横切って造血細胞の循環調べ溢出。このために、間質細胞層を含む第二（下側）インサートは、下部プレート（ 図4）EC単層を含む上部インサート並置した。上述し転生細胞をウェルから回収し、カウントしたように実験を次に行った。結果は、EC単層の下に間質細胞の追加層の挿入は有意にSDF-1に向かって造血細胞（ 図4）の移動を増加させることを実証した。この知見は、局所微小環境は、組織に細胞を循環の動員に寄与するという考えと一致する。

（PM）で区切られた二つの区画から構成されています。 ECは、その後、上部及び下部区画の間に障壁を形成する膜上に成長させる。定義されたせん断応力が一定に注入蠕動ポンプを使用して灌流メディアによる3次元デバイスの上部コンパートメントに適用されます。循環細胞はどちら非相互作用（NIC）は、一過EC（ 'ロール'; RC）との対話、またはEC（AC）に準拠しています。接着細胞の亜集団は、デバイスの下の静的なコンパートメント（TM）へのEC層を横切っ転生B：。3D装置の上面図の描画（上パネル）。 。水平断面図（下のパネル）は、上部膜（赤）の位置が、下の膜（緑）、よく（青）Cの底部を示しています。isometriCビューは、装置の不可欠な部分を示しています。4本のねじ、アクリル先頭ブロック、上部チャンバーシール、上部及び下部膜、底部Oリング、および3 -ウェルアクリルボトムブロックをD：3次元フローの写真チャンバは、蠕動ポンプとガス交換部に接続されている。システムは無菌のフードで組み立てた後、細胞培養インキュベーターに転送されます。

図2。 3Dデバイス·システムの概略図。図は、システムを組み立てるために必要な3つのストップを示している。培養培地を蠕動ポンプによって作成された負圧により、入口からで描かれている。媒体の流れは、インサートが装置内に配置されるようにするストップ＃1によって遮断される。チャンバが閉鎖された後、ポンプはスイットである再びオンCHEDとチャンバーは、直ちに挿入に増殖した細胞の乾燥を防ぐために、媒質で満たされている。 ＃2を停止すると、メディアがガス交換ユニットに配置することができます。 ＃3停止は、フローが入口と出口の接続のために停止することができます。流量は、ポンプのスイッチを使用して、ガス交換部を介して気泡を除去するために時計回りまたは反時計回りの方向に向けることができる。

図3。 3Dデバイスは、生理的せん断応力の条件下での造血前駆細胞のSDF-1媒介輪廻をサポートしています。 ：3つのデバイス（下部コンパートメント内の各含有する3ウェルを）並列で組み立てられ、実行された。培地単独または5または50 ngの/ mlでSDF-1を含む培地を下部コンパートメントのウェルに添加した。ネズミBOneの骨髄細胞を4時間インキュベート装置内を循環させた。その後、各装置は、分解され、SDF-1（イエロー）に向かって転生した細胞は、下側のウェルから収集カウントし、造血成長因子（GF）を添加メチルセルロースで培養した。十四日後、コロニーを顕微鏡下で記録したB：下の区画から回収された前駆細胞の数（コロニー形成細胞、CFC）は、平均値±条件ごとに3つの井戸のSDとして表示されます。 *はp <0.05。

図4。造血細胞と内皮細胞間の相互作用に対する微小環境の影響。 ：図は、培養されたセント、第2多孔質膜の位置を示していますECとアッパー膜下romal線維芽細胞（SF）。他の略語は、 図1Aに記載されているB：。培養SF持つ追加膜（下挿入）は、上部膜の下に挿入されたC：3つのデバイス（それぞれ含む3ウェルを）並列に実行された。培地単独または50 ngの/ mlのSDF-1のSDF-1を含有する媒体は、下部区画のウェルに加えた。ネガティブコントロール室SCは、SDF-1、またはその両方を省略する。骨髄細胞を37℃で4時間循環させたその後、各装置は、分解され、転生細胞を下部コンパートメントのウェルから回収し、計数した。回収された転生細胞の数は、条件ごとに3つのウェルの平均±SDとして表示されます。 *はp <0.05。

Discussion

3Dデバイスは、幹細胞生物学、血管生物学、血液学、腫瘍学、自己免疫、および炎症など様々な分野の研究のために有用な技術である。 3D装置は、幹細胞の血管外遊出カスケードの各ステップを調節する分子機構を調べるために、間葉造血、神経、およびその他の幹細胞を研究する研究者にとって特に有用であろう。細胞遊走を研究する研究者はまた、T及びBリンパ球、単球、好中球、好酸球、NK細胞、およびその他の遊走細胞の遊走異なるメカニズムを調べるために、このデバイスを使用することができる。血管生物学では、装置は、細胞動員をサポートするために、in vitroで血液脳関門を模倣するECの能力に局所微小環境の影響を評価するために有用であろう。疾患の病因に焦点を当てた研究のために、デバイスは、I型糖尿病の間に膵臓細胞傷害性T細胞の遊走を研​​究するために使用することができ、マイル喘息患者の肺への好酸球のグレイション、障害の様々な、癒しのサイトを巻かする細胞の動員、新生血管と細胞傷害性T細胞の相互作用、及び採用における炎症部位への好中球、単球、およびリンパ球の遊走腫瘍への細胞傷害性T細胞である。

小説の3Dデバイスはまた、トランスレーショナル科学および前臨床薬剤開発とスクリーニングのための有用なツールとなるでしょう。例えば、装置は、静脈内投与のための治療用細胞懸濁液の調製を最適化するために、正常組織と比較し負傷組織に治療用細胞の動員をテストするために、その特定の器官または組織内皮および微小環境の役割を調べるために使用することができプロセス。医薬品開発のために、デバイスは、その標的腫瘍細胞の薬物候補をテストし、溢出カスケードの各ステップをブロックする、薬物送達として遊走細胞をテストするために使用することができる腫瘍部位にyが車両、人間の臓器特異的内皮またはローカル組織特異的な微小環境の機能を調節し、ホーミングカスケードの異なるステップを規制薬物の組み合わせをテストするために薬をテストする。最後に、ハイスループット系に変換するとき、デバイスは、標的分子が細胞輸送を媒介することが小分子、ペプチド、お​​よび抗体をスクリーニングするために使用することができる。

技術的な詳細やヒント

流下ローリングと接着が溢出カスケードの重要なステップであり、in vivoでの細胞移動の効率化に大きく貢献。特に、これらの手順は、in vitroで静的アッセイに寄与しない。ただし、静的遊出アッセイは、低親和性の相互作用（ローリング）と強固な接着をサポートするために、ECの機能など、細胞の生存と機能にせん断応力の影響をテストする実験でネガティブコントロールとして有用である。

3Dデバイスでの実験のための媒体の選択は重要です。媒体は、特に長いインキュベーション時間の間、循環細胞の生存に影響を及ぼし得る異なる成長因子を含んでいる。また、カルシウムの濃度は²生理的流れの条件下で、接着剤の相互作用に影響を及ぼす可能性がある⁺及びMg ^{2 +は} 、市販の培養培地中でかなり異なる。 3D装置を用いた実験を計画する際に考慮されるべき他の技術的な詳細については後述する。

EC単分子層の選択

ECの細胞表面署名は、実験設計において考慮されるべき種起源と細胞培養条件の組織を含む様々なパラメータによって影響される。いくつかの一般的に使用されるEC骨EC​​（BMDEC）、脳由来EC（BDEC）、およびHUVECを骨髄由来、肺由来の微小血管EC（LDMVEC）が含まれています。ECの特性もその起源によって異なります。例えば、ローリングと接着を担当するBMDEC恒常急行セレクチンおよびVCAM-1は、BDEC、LDMVEC、およびHUVECは、通常の条件下では、これらの分子を発現しないのに対し。したがって、BDEC、LDMVEC、およびHUVECで被覆されたインサートは、TNFα（10 ngの/ mlで、4時間）又は炎症を模倣し、ホーミング分子の発現を誘導する他の要因で前処理することができる。

局所微小環境とのクロストークのテスト

局所微小環境は、ECの機能を調節し、細胞の血管外漏出にどのように関与するかを理解する上での関心の高まりがあります。我々の結果は、EC単層の下にある間質細胞の単層のものと挿入が著しく循環細胞の血管外漏出を増加を示している。この知見は、ECと間質間のクロストークは、循環細胞の血管外漏出をサポートするECの能力を高めることを示している。 Moreoバージョン、異なる微小環境（ 例えば、間葉系幹細胞、肺線維芽細胞、腫瘍細胞、星状細胞）からの細胞の挿入は、特定の血管床を模倣するように助けることができる。特に、脳由来EC及びアストロサイトの組み合わせは、血液脳関門を模倣するために有用なアプローチであり得る。同様に、患者、又はインビトロで操作正常細胞から得られた細胞は、特定の病気の微小環境を模倣することに役立つ可能性があります。

我々の研究では、50％コンフルエンスまで増殖させ間質細胞と下部インサートを用いる。インサートに微小環境細胞の最適密度は研究の目的に依存しますが、これは容易に操作し、制御することができる。

剪断応力速度を選択する

これは、フォン·アンドリアンらによって実証されているため、0.8ダイン/ cm ²でのせん断応力は、ここで使用した。骨髄microvasculaturにせん断応力であることが造血前駆細胞は、循環を終了し、正常な生理学的条件下で、組織^15を入力して電子。対照的に、せん断応力のより高いレベルは、細胞溢出が限られている大きな血管において観察される。したがって、高剪断応力速度は、様々な細胞型の血管外遊出を調べる実験のための追加の対照として使用することができる。

剪断応力下での細胞の生存、細胞の種類とex vivoでの細胞の処理（ゴンチャロヴァら 、未発表の観察）など、複数の要因に依存し、したがって、試験中に注意深く評価されるべきである。せん断応力の異なるレベル（せん断応力抵抗）細胞の感受性を0.8ダイン/ cmの^2〜6ダイン/ cm ^2のより段階的に剪断応力速度を増加させる蠕動ポンプをプログラミングすることによって評価することができる。これらの試験の間に、細胞を用いて細胞死を監視するためのガス交換室から定期的に収集することができるトリパンブルー排除、アネキシンVおよびPI染色、及びアポ​​トーシスマーカー発現として言う。

実験は実質由来のex vivoで操作された細胞または細胞の剪断応力抵抗性をテストするために設計されている場合、それは、血液媒介細胞などの追加の陽性対照は、実験に含まれていることが推奨される。

挿入孔サイズとECMコーティングの選択

インサートは、いくつかの細孔径（3、5、8ミクロン）を用意しています。細孔径の選択は、循環テストセルのサイズと性質に依存し、これは、静的トランスウェルアッセイの場合である。大孔径（8μmの）とインサートはそのような上皮起源の腫瘍細胞などの大型細胞の血管外漏出をテストすることをお勧めします。白血球または造血幹細胞は、より一般的に5μmの細孔インサートでテストされており、3μmの細孔インサートが最善秒の血管外漏出をテストするために予約されていますメガワット以下細胞。しかし、単独のテストセルのサイズが唯一の重要な要因ではないと我々はいくつかの細孔径と挿入のテストをお勧めします。

我々の最初の研究では、インサート上でECの増殖を支持し、> 4時間せん断応力に耐えられるようにそれらの能力のための様々なECMをテストした。 ECMは、マトリゲル、ポリD-リジン、フィブロネクチン、ラミニン、入力が含まれてテストされたI型コラーゲン、ハイドロゲル、メタケラチンI、II、III、IV、および細胞外。 ECの成長のための最良の結果は、細胞外、フィブロネクチン、コラーゲンが得られた。しかし、我々の手の中に、0.8μgの/ cm ^2の細胞外ではかなり膜を横切って試験細胞の遊出を減少させた。したがって、我々は今、挿入のコーティングのためフィブロネクチン（5μgの個/ cm ^2）またはコラーゲン（5μgの/ cm ^2）を使用しています。しかしながら、ECMの最適な選択は、おそらく、ECの種類及び試験セルの移住する特性の両方によって影響される。予備実験は、integriをテストするために行われるべき選択されたECM上に成長したEC単層のTY。例えば、培養液で満たされたペトリ皿でのEC単層を持つ場所が予め被覆インサートは、せん断応力（低設定）を作成するシェーカー上皿を置き、37℃、5％12時間CO _2。せん断応力に暴露した後ECの整合性がクリスタルバイオレット染色法を用いて評価することができる。

最適なテストセル濃度の選択

循環を終了する試験細胞の能力は、各細胞型に特異的な多くの特性に依存する。統計的に有意な結果を生成するために、循環細胞密度は、十分な数の細胞を陽性対照ウェルに移行することを確実にするために最適化されなければならない。したがって、我々はシステムにロードされた細胞の数との関係を理解するために細胞密度の範囲（ 例えば 、10 ³ / mlの^10〜7 / ml）で初期テストを行うことをお勧め転生を受ける細胞の数。

また、最適な循環濃度は、異なるソースから取得した同じ細胞型に異なっていてもよい。例えば、CD34 ⁺細胞は、造血幹細胞およびコミットされた系統特異前駆細胞の両方を含む不均一な細胞集団である。それらは骨髄から得ることができる、末梢血および臍帯血を動員。これらの3つのソースから派生したCD34 ^+細胞は異なるホーミングと移植能力の^16-18を持っ^ている、3Dデバイスでこれらの細胞をテストするための条件は、本格的な調査の前に最適化する必要がありそう。

最適な細胞の循環時間を選択する

最適な循環時間は、各セルタイプに対して経験的に決定されるべきである。循環に必要な最小時間は、静的遊走アッセイの結果から推定することができるが、これはextenかもよい細胞はせん断応力を受けたときDEDに。 4と96時間の間の循環時間をテストパイロット研究が推奨されています。

ガス交換ユニット

ガス交換部の主な目的は、標準的な組織培養インキュベーターの設定と同様に、3Dデバイスを介して循環する媒体中のCO ₂の最適濃度を維持することである。ガス交換ユニットは、試験細胞と化合物を添加するため、試験中にプローブとサンプルを収集するために使用することができる。

テストセル数の評価

循環細胞は、ガス交換部を介して実験中に変化するタイミングでサンプリングすることができる。実験の最後に、循環中に残留する細胞は出口から収集することができる。 3Dデバイスは、実験の終了時に分解されたとき、転生細胞は、下部ウェルから採取およびfを回収することができるまたはさらなる分析。入力セルにラベルされている場合は、転生細胞はトリパンブルーと微視的に列挙された生/死細胞で染色することができます。あるいは、入力セルは、3Dデバイスにロードする前に、生細胞のイメージングのために利用できる多くの "セルトラッカー"色素のいずれかで標識することができ、この場合には、採取した細胞を転生蛍光の定量に溶解されるべきである。

最適なサンプルサイズを選択する

統計分析を可能にするために、サンプルサイズは、両側t検定を用いて、0.05の有意水準で試験した両群間の平均変化率で仮想的な差を検出するのに約80％の電力を提供するよう選択されな​​ければならない。骨髄細胞を用いた我々の経験に基づいて、我々は、3Dデバイスの実験のために実験条件ごとに3つの井戸を使用しています。しかし、最適なサンプルサイズは、実験の目的に応じて変化する電子を決定すべきであるmpirically。重回帰統計的検定、両側t検定、および分散分析は、結果の統計的妥当性を検証するために使用することができる。

ケモカインの選択

すべての移住アッセイとしては、化学誘引物質の選択は試験細胞の性質と研究の目的によって決定されます。 SDF-1は、造血細胞のための十分に確立された化学誘引物質である。我々の手では、50 ngの/ mlのSDF-1の濃度は、骨髄由来造血前駆細胞の血管外遊出を促進することが最適であった。また、間葉系幹細胞¹⁹化学誘引物質としてC3aのおよびbFGFを使用しています。しかし、我々は本格的な調査の前に最適な濃度範囲を識別するケモカインの各ケモカインとクロス滴定の組み合わせを滴定をお勧めします。特定の細胞型については、走化性因子の組み合わせは有益であり得る。特定のテストセルのためのケモカインは詐欺、不明または使用できない場合刺激されたリンパ球、線維芽細胞および他の細胞から培地をditioned化学誘引物質の供給源として使用することができる。

読み出しパラメータの選択

3Dデバイスの汎用性は、行うことができ、実験の成功は、思慮深い配慮と読み出しパラメータの設計に依存することになる転生実験の種類を拡大していきます。原則として、細胞が上方（循環）区画から収集され、下側（静的）区画は、細胞計数と同時に生存能力について試験されるべきである。一部の細胞は、微小血管で観察生理せん断応力に低い耐性を持っています。この場合には、死んだ細胞の数は上側区画に増加する。 EC層上に（又は捕捉された）逮捕付着細胞の数は、試験細胞によって特異的に発現するマーカーの免疫細胞化学により評価することができる。 CD31およびvWFのに特異的な抗体を使用することができるECを検出すると、試験細胞およびECとの間の区別を可能にする。また、EC単層の完全性が各試験の最後に監視されるべきである。

回収した細胞を用いて行わ分析の種類は研究者 '実験的な目標に依存しますが、マイクロアレイや定量PCR、FACS分析による表面分子の発現、FACSとウェスタンブロッティングによってシグナル伝達経路の活性化、および要因によって遺伝子発現の解析の変更を含めることができますELISAによる分泌。我々は、造血前駆細胞（ 図3）を列挙するために転生した骨髄細胞を培養している私たち自身の仕事によって証明されるように機能テストの巨大な配列は、in vitroで回収した細胞上で可能です。収集されたサンプルはまた、in vivoアッセイの様々でテストすることができます。

in vivoで試験細胞の挙動を予測するのを助けることができる1つの重要なパラメータは、傾向であるせん断応力の異なるレートの下で凝集体を形成するためにいくつかの細胞のency。例えば、3Dデバイス内凝集体形成を受ける治療用細胞は、静脈内投与後の塊を形成し、in vivoでの急性血管閉塞（ゴンチャロヴァら 、未発表の観察）が発生する傾向があるかもしれません。凝集体形成は、3Dデバイス実験の終了時に又は後の試験セルをサンプリングすることによって顕微鏡でモニターすることができる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8)	Watson-Marlow Limitid	981.0142.000
3D Chamber	C.B.S.Scientific	FC-1000
Gas exchange unit	C.B.S.Scientific	FCR-1000
Inserts	C.B.S.Scientific	FCI-1005U
Collagen Bovine,Type I	BD Biosciences	354231
Hydrochloric Acid 0.1M	VWR	BDH3200-1
PBS	Invitrogen	14190
HUVEC	Lonza	CC- 2517
EGM Bullet Kit (cc - 3121 & cc - 4133)	Lonza	CC - 3124
Trypsin Neutralizing Solution	Lonza	CC-5002
Trypsin	Lonza	CC-5012
HEPES	Lonza	CC-5024
SDF-1	R7D System	460-SD
Extracel Trial 2.5 Kit	Glycosam Byosystems	GS211
Fibronectin, human , nature	BD Biosciences	356008
Poly-D-lysine	Millipore	A-003-E
BD Matrigel	BD Biosciences	354277
Human Brain Microvascular Endothelial Cells	ScienCell	1000
Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells	ScienCell	1001
Trypan Blue	StemCells Tecnologies	7050
TNF-alfa, 10 μg	Invitrogen	PHC3015
VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC	Southern Bioteck	9519-02
Propidium Iodide Staining Solutuion	BD Pharmingen	# 556463
Frozen Human Cord Blood CD34+ cells	StemCell	CB007F
Frozen Human Cord Blood CD34+ cells	Zenbio	SER - CD34-F
MethoCult GF M3434	StemCells Tecnologies	GFM3434
Mouse Methylcellulose complete media	R&D	HSC007
Anti-Von Willibrand Factor antibody	abcam	C# ab11713
Petry dish (35 x 10 mm)	VWR	CA25373-041
15 ml tubes	VWR Fisher	21008 - 918
Tissue culture flasks 75cm2	VWR	BD353136
Cristal violet	Sigma	C-3886-25G
Dissecting forceps, curved	VWR	82027-384
1,000 μl Pipette tips	VWR	83007-380
1 - 200 μl Pipette tips	VWR	37001-530
Equipment
Peristaltic pump	Watson-Marlow Limitid	403U/VM3