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의학

パーキンソン病における感受性メカニズムのマスク解除を行う遺伝子環境相互作用モデル

Published: January 07, 2014
doi:
10.3791/50960
, , ,
1Center for Health Sciences,SRI International, 2Department of Chemistry and Biochemistry,University of California-Santa Cruz

Summary

リポキシゲナーゼ (LOX) イソザイムは、神経炎症や神経変性を増減する可能性のある製品を生成できます。.遺伝子環境相互作用研究は、LOXアイソザイム特異的な効果を同定することができる。1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)モデルを2つのLOXアイソザイム欠損トランスジェニックラインでニグロストリアチン系の損傷を用い、ドーパミン作動性および炎症に対するLOXイソザイムの寄与を比較することができる。

Abstract

リポキシゲナーゼ(LOX)活性は、アルツハイマー病などの神経変性疾患に関与しているが、パーキンソン病(PD)の病因におけるその効果はあまり理解されていない。遺伝子環境相互作用モデルは、単独で遺伝的または毒性のある疾患モデルだけでは観察されない毒性における特定の細胞経路の影響をマスク解除する有用性を有する。異なるLOXアイソザイムが選択的にPD関連神経変性に寄与しているかどうかを評価するために、トランスジェニック(すなわち 5-LOXおよび12/15-LOX欠損)マウスは、障害における細胞損傷および死を模倣する毒素で挑戦することができる。ここでは、PDに関連する神経変性に対するLOXイソザイムの明確な寄与を解明するためにニグロストリアザル病変を産生する神経毒1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)の使用について説明する。マウスにおけるMPTPの使用、および非ヒト霊長類は、PDにおけるニグロストリアティカル損傷を再現するために十分に確立されている。MPTP誘導病変の程度は、ドーパミンとその代謝産物のHPLC分析と、ドーパミンの合成に対する速度制限酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)に対する線条体の半定量的なウェスタンブロット分析によって測定される。炎症性マーカーを評価するために、LOXイソザイム選択的感受性を実証し得る、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)およびIba-1免疫ヒスロトケミストリーは、立体ニグラを含む脳切片に対して行われ、GFAPウェスタンブロット分析は線条皮ホモジネートに対して行われる。この実験的アプローチは、ニグロストリアトリアティアルジェネレーションとPDの基礎となる遺伝子環境相互作用に関する新しい洞察を提供することができる。

Introduction

遺伝子環境相互作用モデルの使用は、特発性パーキンソン病(PD)に影響を及ぼす可能性のある危険因子を模倣するアプローチを提供し、遺伝的または毒性のあるシステムの単独使用によって解明される可能性が低い機械学的洞察を識別する機会を与える1,2。ここでは、この点を説明し、神経炎症および毒性に対するリポキシゲナーゼ(LOX)イソザイム活性をよりよく理解するために、ニグストリアティール変性3の1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)マウスモデルの応用を説明する。LOXアイソザイムの役割は、脳卒中7およびアルツハイマー病8,9を含む末梢疾患5,6とCNS疾患において広く評価されているが、PDに関連するニグロストリエータル機能および変性におけるアイソザイムの家族の役割はよく理解されておらず、研究を保証する。MPTP神経毒は、ニグロストリアティカル経路の優遇変性を示し、PD患者10における運動障害の根本である線条体ドーパミン枯渇およびニグラードパミン作動性細胞喪失を再現する。このモデルは、非運動および運動PDの挙動および率直なαシヌクレイン陽性Lewy身体病理学の完全なカドレを再現していないが、それは確実に三元性ドーパミン損失を伴うニガラル細胞死を生み出すために利用可能な最良の特徴非侵襲モデルであるため、ニグロストリアトリ物質損傷に寄与する新しい機械学的標的を解明し、初期段階の翻訳試験に有用であった。MPTPマウスの広い使用は、急性、亜急性から慢性16-18までのパラダイムを用いて、治療レジメン18,21,22に応じて毒性の異なるメカニズムの活性化を伴う軽度から重度のニグロストリアタル損傷を生じさせる投薬の標準化を可能にした。その結果、23-25を利用した治療薬またはトランスジェニックモデルに応じて、ニグロストリアザルタル傷害の増強または減少を引き起こし得る「病変の窓」を標的とすることを可能にする。

また、トランスレーショナルおよびディスカバリー生物学研究には、損傷を評価するために使用される技術と、そのような方法が提供する証拠も不可欠です。MPTPマウスモデルについては、病変を評価するための確立された指標は、ドーパミンおよびその代謝産物を含む線条体ドーパミン作動性トーンのマーカーの測定であり、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)のウェスタンブロット分析、ドーパミン合成における速度制限酵素、および西洋ブロットおよび免疫化学を用いたグリア活性化などの変性事象の指標である。これらは古典的な神経化学的、生化学的、および組織学的手順であるが、この技術は、ニグロストリアザルトパミン作動経路内の損傷の程度に関する重要かつ再現性のある読み出しを提供し、毒性のメカニズムを示し、PDにおける変性事象を理解する上で貴重なツールであることが証明されている。

Protocol

注:すべての動物の手順と動物のケア方法は、機関の施設動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されるべきです。ここで説明する研究は、SRIインターナショナルのIACUCによって確立されたガイドラインに従って行われました。 1. LOX欠損マウスの取得と維持 5-LOX欠損または12/15-LOX欠損マウスおよびそれぞれの株および性一?…

Representative Results

この毒素暴露パラダイムは、MPTP-対生理食動物の中で、有意かつ検出可能な20%の線条体ドーパミン枯渇を生じさせることができる。MPTP の異なるロットは、わずかに多かれ少なかれ病変をもたらす可能性があることに注意することが重要です。したがって、より良い精度のために、新しい多くのニューロトキシンが利用される場合、トランスジェニックで使用する前に野生型マウスの予備実験…

Discussion

この遺伝子環境相互作用研究の設計により、ニグロストリアタル経路における5-LOXアイソザイムの二重性に関する新しい情報を得ることを可能にしました。5-LOXイソザイムとその野生型のゴミを欠いたトランスジェニックでの生理食素またはMPTP治療後にHPLCを測定することで、その欠乏は毒性条件下で保護されているように見えるが、通常の条件下では酵素の欠乏は線条体ドーパ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、国立衛生研究所NIGMS 056062によって資金提供されました。

Materials

1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL) Sigma-Aldrich M0896 for PD modeling
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA) American MasterTech Scientific BUP0157 for immersion fixation
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA) Sigma-Aldrich 244252 for HPLC acid extraction
Tris Base Sigma-Aldrich T1503 for tissue homogenization
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E1644 for tissue homogenization
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 for tissue homogenization
Phosphatase inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P5726 for tissue homogenization
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881 for Lowry protein assay
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC)  Sigma-Aldrich S0389 for cryoprotection
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS) Sigma-Aldrich P3813 for IHC
BCA Protein Assay Kit Pierce/Thermo 23225 for protein determination
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-well Invitrogen/Life Technologies EC60052BOX for SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Invitrogen/Life Technologies NP0007 for SDS-PAGE
Novex Sharp Prestained Protein Standard  Invitrogen/Life Technologies LC5800 protein ladder
Glycine Sigma-Aldrich G7126 for SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS) Sigma-Aldrich L3771 for SDS-PAGE
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent  American MasterTech Scientific SPM1057C methanol for transfer
Sodium chloride (NaCl), ACS reagent Sigma-Aldrich S9888 saline and buffers
Nonfat dry milk powder Carnation n/a for immunoblotting
Ponceau S solution in 5% acetic acid  Sigma-Aldrich P7170 for immunoblotting
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonal Chemicon/Millipore AB1542 for immunofluorescence 
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonal Pel-Freez Biologicals P40101-0 for immunoblotting
Anti-β Actin, rabbit Sigma-Aldrich A2066 for immunoblotting
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonal Chemicon/Millipore AB5804 for immunofluorescence
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonal Covance Inc. SMI-22R for immunoblotting
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 for immunoblotting
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated  Fisher Scientific 31462 for immunofluorescence
goat anti-sheep, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31480 for immunofluorescence
goat anti-mouse, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31430 for immunofluorescence
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Pierce/Thermo 34078 for immunoblotting
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in  Pierce/Thermo 34089 for immunoblotting
Restore Western Blot Stripping Buffer  Pierce/Thermo 21059 for immunoblotting
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0%  Sigma-Aldrich C1909 for IHC
Normal Donkey Serum Millipore S30-100ML for IHC
Polyvinylpyrrolidone (PVP) Sigma-Aldrich P5288 for IHC
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized Sigma-Aldrich A3294 for IHC
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-01 for IHC
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled  Invitrogen/Life Technologies A10042 for IHC
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC  Jackson ImmunoResearch 713-095-147 for IHC
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1500 for IHC
Normal Goat Serum Millipore S26-100ML for IHC
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG )  Vector Laboratories PK-4001 for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions )
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidine Vector Laboratories SK-4100 for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use)
Hydrogen peroxide, 30% Sigma-Aldrich 216763 for quench step in IHC
Rabbit anti-Iba1 Biocare Medicals CP290A for IHC
Cresyl Violet Solution, Regular Strength  FD Neurotechnologies PS102-01  counterstain for Iba1 IHC
95% Ethanol, reagent alcohol Sigma-Aldrich R8382 dehydration for IHC
100% Absolute ethanol Mallinckrodt  7019-10 dehydration for IHC
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283 destaining for IHC
Xylene Sigma-Aldrich 534056 clearing agent for IHC
DPX Mountant Sigma-Aldrich 06522 mounting medium for DAB IHC
O.C.T. Compound – Frozen Section Embedding Medium  American MasterTech Scientific EMOCTCS embeddium medium for cryostat cutting
Potassium permanganate Sigma-Aldrich 223468 to decontaminate DAB solution
Dopamine hydrochloride Sigma-Aldrich H8502 for HPLC
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) Sigma-Aldrich 850217 for HPLC
Homovanillic acid (HVA) Sigma-Aldrich H1252 for HPLC
Perchloric acid (PCA) – 70% Sigma-Aldrich 244252 for HPLC
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Sigma-Aldrich 71504 for HPLC
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich C1909 for HPLC
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA) Sigma-Aldrich O8380 for HPLC
EDTA Sigma-Aldrich E1644 for HPLC
Acetonitrile EMD AX0145-1 for HPLC
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O) Millipore for HPLC
0.22 µm GSTF membrane Millipore for filtration
Corning Netwells Sigma-Aldrich CLS3477 polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC
[header]
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150) MSE MSE.41371.274
Microcentrifuge Eppendorf 5414R
ESA MD-150 reverse-phase column  ESA
HPLC Pump (Ultimate 3000) Dionex ISO-3100BM
HPLC Autosampler (Ultimate 3000) Dionex WPS-3000TSL
Electrochemical detector ESA Coulochem III
Guard Cell ESA 5020
Analytical Cell ESA 5011A
Chromeleon software Dionex
Eclipse E400 Nikon E400 light/fluorescent microscope
Disposable mouse cage Ancare N10HT
Microfilter top Ancare N10MBT
[header]
5-LOX- deficient mice The Jackson Laboratory 004155
12/15-LOX-deficient mice The Jackson Laboratory 002778
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References

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Chou, V. P., Ko, N., Holman, T. R., Manning-Boğ, A. B. Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson’s Disease. J. Vis. Exp. (83), e50960, doi:10.3791/50960 (2014).
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