Lipoxygenase (LOX) isozymes 증가 또는 증가 시킬 수 있는 제품을 생성할 수 있습니다 또는 신경 염증 및 신경 변성. 유전자 환경 상호 작용 연구 LOX isozyme 특이적 효과 식별할 수 있습니다. 두 개의 LOX isozyme-결핍 형 형질 라인에서 니그로스트리아탈 손상의 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 모델을 사용하면 도파미너기크 및 염증에 대한 LOX 이소지메의 기여도를 비교할 수 있습니다.
Lipoxygenase (LOX) 활동은 알츠하이머 병과 같은 신경 퇴행성 질환에 연루되었지만 파킨슨 병 (PD) 병기 발생에 미치는 영향은 덜 이해됩니다. 유전자 환경 상호 작용 모델은 단독으로 유전 적 또는 독성 질병 모델을 사용하여 관찰되지 않을 수 있는 독성에 있는 특정 세포 통로의 충격을 마스킹해제에 있는 유틸리티가 있습니다. 뚜렷한 LOX 이소지메스가 PD 관련 신경변성에 선택적으로 기여하는지 평가하기 위해,형질전환(즉, 5-LOX 및 12/15-LOX 결핍) 마우스는 장애에서 세포 손상과 사망을 모방한 독소로 도전할 수 있다. 여기서 우리는 PD와 관련된 신경 변성에 LOX isozymes의 뚜렷한 기여를 해명하기 위해 nigrostriatal 병변을 생성하는 신경 독소, 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6 테트라 하이드로피리딘 (MPTP)의 사용을 설명합니다. 마우스에 MPTP의 사용, 비 인간 영장류, PD의 nigrostriatal 손상을 재현하기 위해 잘 설립된다. MPTP 유도 병변의 정도는 도파민의 HPLC 분석과 대사산물 및 티로신 하이드록실라제(TH)에 대한 스트리에이텀의 반정성 서양 얼룩 분석에 의해 측정되며, 도파민합성을 위한 속도 제한 효소이다. LOX 이소지메 선택적 감도를 입증할 수 있는 염증성 마커를 평가하기 위해, 글리아 세동 산성 단백질(GFAP) 및 이바-1 면역조직화학은 실질적인 니그라를 함유하는 뇌 단면에서 수행되며, GFAP 웨스턴 블롯 분석은 현저균질상에서 수행된다. 이 실험적인 접근은 nigrostriatal 변성 및 PD의 근본적인 유전자 환경 상호 작용에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.
유전자 환경 상호 작용 모델의 사용은 특발성 파킨슨 병 (PD)에 영향을 미칠 가능성이 있는 위험 요소를 모방하는 접근법을 제공하고 유전적 또는 독성 시스템만1,2를사용하여 해명될 가능성이 없는 기계론적 통찰력을 분별할 수 있는 기회를 제공한다. 여기서 우리는 이 점을 설명하고 신경염증 및독성에대한 립산소증(LOX)의 선택성을 더 잘 이해하기 위해 니그로스트리아탈 변성3의 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 마우스 모델의 적용을 설명한다. LOX isozymes에 대한 역할은 뇌졸중7 및 알츠하이머 병8,9를포함한 CNS 질환뿐만 아니라 말초 장애5,6에서 널리 평가되었지만, PD와 관련된 니그로스 트리아탈 기능 및 변성에서 이소지메의 가족의 역할은 잘 이해되지 않고 연구를 보증한다. MPTP 신경독소는 니그로스트리아탈 통로의 우대변성을 입증하고 PD환자(10)의운동장애를 뒷받침하는 스트루아탈 도파민 고갈 및 니그랄 도파민 세포 손실을 재구성한다. 이 모델은 비운동 및 모터 PD 행동과 솔직한 α-synuclein 양성 Lewy 신체 병리학의 전체 간부를 재현하지는 않지만, 111에 의해 안정적으로 nigral cell death를 생산할 수 있는 최고의 특성이 있는 비침범성 모델이기 때문에 nigrostriatal 손상및초기 단계 번역 테스트에 기여하는 새로운 기계성 표적을 해명하는 데 유용했습니다. 급성, 아급성에서 만성16-18에이르기까지 패러다임으로 MPTP 마우스의 광범위한 사용은 치료요법18,21,22에따라 다른 독성 메커니즘의 활성화와 함께19,20에서 심한 nigrostriatal 손상으로 가벼운 결과를 초래하는 투약의 표준화를 허용했다. 따라서, 이는23-25를활용한 치료제 또는 형질전환 모델에 따라 개선되거나 감소된 니그로스트라탈 손상을 초래할 수 있는 ‘병변의 창’을 허용한다.
또한 번역 및 발견 생물학 연구 결과에 필수적인 손상을 평가하는 데 사용되는 기술과 그러한 방법이 제공하는 증거입니다. MPTP 마우스 모델의 경우, 병변을 평가하기 위한 확립된 지표는 HPLC에 의한 도파민 및 대사산물을 포함한 현트리아탈 도파민의 마커, 티로신 하이드록실라제(TH), 도파민 합성의 속도 제한 효소 및 면역학적 인 비올레를 이용한 퇴행성 발생의지표이다. 이들은 고전적인 신경 화학, 생화학적, 및 조직학적 절차이지만, 기술은 nigrostriatal dopaminergic 통로 내의 손상의 정도에 중요하고 재현 가능한 판독을 제공하고, 독성의 메커니즘을 나타내며, PD의 퇴행성 사건을 이해하는 데 중요한 도구가 입증되었습니다.
이 유전자 환경 상호 작용 연구의 디자인은 우리가 nigrostriatal 통로에 있는 5-LOX isozyme의 이중 본질에 관하여 새로운 정보를 얻기 위하여 허용했습니다. 5-LOX 이소지메와 그들의 야생형 쓰레기메이트가 결핍된 형질 성 전환기에서 식염수 또는 MPTP 처리 후에 striatal monoamines를 측정하기 위하여 HPLC를 수행해서, 우리는 그것의 결핍이 독성 조건하에서 보호되는 것처럼 보인다는 것을 주의할 수 있었습?…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 건강 NIGMS 056062의 국가 학회에 의해 투자되었다.
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL) | Sigma-Aldrich | M0896 | for PD modeling | |
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA) | American MasterTech Scientific | BUP0157 | for immersion fixation | |
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA) | Sigma-Aldrich | 244252 | for HPLC acid extraction | |
Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | for tissue homogenization | |
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E1644 | for tissue homogenization | |
Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | for tissue homogenization | |
Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P5726 | for tissue homogenization | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | for Lowry protein assay | |
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389 | for cryoprotection | |
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | for IHC | |
BCA Protein Assay Kit | Pierce/Thermo | 23225 | for protein determination | |
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-well | Invitrogen/Life Technologies | EC60052BOX | for SDS-PAGE | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 | for SDS-PAGE | |
Novex Sharp Prestained Protein Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5800 | protein ladder | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for SDS-PAGE | |
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | for SDS-PAGE | |
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent | American MasterTech Scientific | SPM1057C | methanol for transfer | |
Sodium chloride (NaCl), ACS reagent | Sigma-Aldrich | S9888 | saline and buffers | |
Nonfat dry milk powder | Carnation | n/a | for immunoblotting | |
Ponceau S solution in 5% acetic acid | Sigma-Aldrich | P7170 | for immunoblotting | |
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonal | Chemicon/Millipore | AB1542 | for immunofluorescence | |
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonal | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | for immunoblotting | |
Anti-β Actin, rabbit | Sigma-Aldrich | A2066 | for immunoblotting | |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonal | Chemicon/Millipore | AB5804 | for immunofluorescence | |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonal | Covance Inc. | SMI-22R | for immunoblotting | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | for immunoblotting | |
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated | Fisher Scientific | 31462 | for immunofluorescence | |
goat anti-sheep, peroxidase conjugated | Pierce/Thermo | 31480 | for immunofluorescence | |
goat anti-mouse, peroxidase conjugated | Pierce/Thermo | 31430 | for immunofluorescence | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Pierce/Thermo | 34078 | for immunoblotting | |
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in | Pierce/Thermo | 34089 | for immunoblotting | |
Restore Western Blot Stripping Buffer | Pierce/Thermo | 21059 | for immunoblotting | |
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | C1909 | for IHC | |
Normal Donkey Serum | Millipore | S30-100ML | for IHC | |
Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Sigma-Aldrich | P5288 | for IHC | |
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized | Sigma-Aldrich | A3294 | for IHC | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-01 | for IHC | |
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled | Invitrogen/Life Technologies | A10042 | for IHC | |
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC | Jackson ImmunoResearch | 713-095-147 | for IHC | |
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | for IHC | |
Normal Goat Serum | Millipore | S26-100ML | for IHC | |
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG ) | Vector Laboratories | PK-4001 | for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions ) | |
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidine | Vector Laboratories | SK-4100 | for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use) | |
Hydrogen peroxide, 30% | Sigma-Aldrich | 216763 | for quench step in IHC | |
Rabbit anti-Iba1 | Biocare Medicals | CP290A | for IHC | |
Cresyl Violet Solution, Regular Strength | FD Neurotechnologies | PS102-01 | counterstain for Iba1 IHC | |
95% Ethanol, reagent alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | dehydration for IHC | |
100% Absolute ethanol | Mallinckrodt | 7019-10 | dehydration for IHC | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | destaining for IHC | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | clearing agent for IHC | |
DPX Mountant | Sigma-Aldrich | 06522 | mounting medium for DAB IHC | |
O.C.T. Compound – Frozen Section Embedding Medium | American MasterTech Scientific | EMOCTCS | embeddium medium for cryostat cutting | |
Potassium permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | to decontaminate DAB solution | |
Dopamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H8502 | for HPLC | |
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) | Sigma-Aldrich | 850217 | for HPLC | |
Homovanillic acid (HVA) | Sigma-Aldrich | H1252 | for HPLC | |
Perchloric acid (PCA) – 70% | Sigma-Aldrich | 244252 | for HPLC | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Sigma-Aldrich | 71504 | for HPLC | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | for HPLC | |
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA) | Sigma-Aldrich | O8380 | for HPLC | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | for HPLC | |
Acetonitrile | EMD | AX0145-1 | for HPLC | |
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O) | Millipore | for HPLC | ||
0.22 µm GSTF membrane | Millipore | for filtration | ||
Corning Netwells | Sigma-Aldrich | CLS3477 | polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC | |
[header] | ||||
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150) | MSE | MSE.41371.274 | ||
Microcentrifuge | Eppendorf | 5414R | ||
ESA MD-150 reverse-phase column | ESA | |||
HPLC Pump (Ultimate 3000) | Dionex | ISO-3100BM | ||
HPLC Autosampler (Ultimate 3000) | Dionex | WPS-3000TSL | ||
Electrochemical detector | ESA | Coulochem III | ||
Guard Cell | ESA | 5020 | ||
Analytical Cell | ESA | 5011A | ||
Chromeleon software | Dionex | |||
Eclipse E400 | Nikon | E400 | light/fluorescent microscope | |
Disposable mouse cage | Ancare | N10HT | ||
Microfilter top | Ancare | N10MBT | ||
[header] | ||||
5-LOX- deficient mice | The Jackson Laboratory | 004155 | ||
12/15-LOX-deficient mice | The Jackson Laboratory | 002778 |