Os isozimos lipoxygenase (LOX) podem gerar produtos que podem aumentar ou diminuir a neuroinflamação e neurodegeneração. Um estudo de interação gene-ambiente poderia identificar efeitos específicos da isozyme lox. Utilizando o modelo 1-metil-4-fenil-1,2,3,3,6-tetrahidropyridine (MPTP) de dano nigrostriatal em duas linhas transgênicas deficientes de isozim lox permite comparar a contribuição de isozimes LOX na integridade e inflamação do dopaminérgico.
A atividade lipoxygenase (LOX) tem sido implicada em doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer, mas seus efeitos na patogênese da doença de Parkinson (DP) são menos compreendidos. Modelos de interação gene-ambiente têm utilidade em desmascarar o impacto de vias celulares específicas na toxicidade que podem não ser observadas usando apenas um modelo de doença genética ou toxicante. Para avaliar se isozymes LOX distintos contribuem seletivamente para a neurodegeneração relacionada à DP, os camundongos transgênicos(ou seja, 5-LOX e 12/15-LOX deficientes) podem ser desafiados com uma toxina que imita lesões celulares e morte na doença. Aqui descrevemos o uso de uma neurotoxina, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropyridina (MPTP), que produz uma lesão nigrostriatal para elucidar as distintas contribuições de isozimes LOX para neurodegeneração relacionada à DP. O uso de MPTP em camundongos, e primatas não humanos, é bem estabelecido para recapitular o dano nigrostriatal em DP. A extensão da lesão induzida pelo MPTP é medida pela análise hplc da dopamina e seus metabólitos e análise de manchas ocidentais semi-quantitativas de estriato para hidroxilase de tyrosina (TH), a enzima limitante de taxa para a síntese de dopamina. Para avaliar marcadores inflamatórios, que podem demonstrar sensibilidade lox isozyme-seletiva, proteína ácida fibrilar gliana (GFAP) e imunohistoquímica Iba-1 são realizadas em seções cerebrais contendo nigra substantia, e a análise de manchas ocidentais GFAP é realizada em homogeneados estriais. Esta abordagem experimental pode fornecer novas percepções sobre as interações gene-ambiente subjacentes à degeneração nigrostriatal e DP.
O uso de modelos de interação gene-ambiente fornece uma abordagem para imitar fatores de risco que provavelmente influenciam a doença idiopática de Parkinson (DP) e oferece a oportunidade de discernir insights mecanicistas que dificilmente serão elucidados pelo uso de um sistema genético ou toxicantesozinho 1,2. Aqui ilustramos este ponto e descrevemos a aplicação do modelo de camundongos 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropyridine (MPTP) modelo de degeneração nigrostriatal3 para entender melhor a seletividade da atividade de isozínia lipoxygenase (LOX) sobre neuroinflamação e toxicidade4. Embora um papel para isozymes LOX tenha sido amplamente avaliado em distúrbios periféricos5,6, bem como doença de SNC, incluindo AVC7 e Doença de Alzheimer8,9, o papel da família de isozymes na função nigrostriatal e degeneração relacionada à DPN não é bem compreendido e merece estudo. A neurotoxina MPTP demonstra degeneração preferencial da via nigrostriatal e recapitula o esgotamento da dopamina sttartal e a perda de células dopaminérgicas nigral que sustentam prejuízos motoricos em pacientes com DP10. Embora este modelo não reproduza o quadro completo de comportamentos de DP não motor e motor e patologia corporal lewy α-sinuclein-positiva, tem sido útil para elucidar novos alvos mecanicistas que contribuem para danos nigrostriais e para testes translacionais em estágio inicial, pois é o modelo não invasivo mais bem caracterizado disponível para produzir de forma confiável a morte celular nigral acompanhada pela perda de dopamina striatal11-15. O uso amplo do camundongo MPTP, com paradigmas que vão do agudo, subaguto ao crônico16-18,permitiu que a padronização da dosagem resultasse em danos leves a graves de nigrostriatal19,20 com ativação de diferentes mecanismos de toxicidade dependendo do regime de tratamentonº 18,21,22. Consequentemente, isso permite que seja direcionada uma “janela de lesão” que pode resultar em lesão nigrostriatal aprimorada ou reduzida, dependendo do agente terapêutico ou modelo transgênico utilizado23-25.
Também essenciais para estudos de biologia translacional e de descoberta são as técnicas utilizadas para avaliar danos e as evidências que tais métodos fornecem. Para o modelo de mouse MPTP, Métricas estabelecidas para avaliar a lesão são a medição de marcadores de tom dopaminérgico estriatal, incluindo dopamina e seus metabólitos pelo HPLC, e análise de manchas ocidentais de hidroxilase tyrosina (TH), a enzima que limita a taxa na síntese de dopamina, e indicadores de eventos degenerativos como a ativação glial utilizando análise de manchas ocidentais e imunohistoquímica4. Embora sejam procedimentos neuroquímicos clássicos, bioquímicos e histológicos, as técnicas fornecem leituras críticas e reprodutíveis sobre a extensão dos danos dentro da via nigrostriatal dopaminérgica, indicam mecanismos de toxicidade e provaram ser ferramentas valiosas na compreensão de eventos degenerativos em DP.
O projeto deste estudo de interação gene-ambiente nos permitiu obter novas informações sobre a dupla natureza da isozyme 5-LOX na via nigrostriatal. Ao realizar o HPLC para medir as monoaminas estriais após o tratamento salino ou MPTP em transgênicos sem a isozice de 5-LOX e seus ninhadas de tipo selvagem, pudemos notar que sua deficiência parece ser protetora em condições tóxicas(Figura 1),mas em condições normais, a falta da enzima reduz os níveis de dopamina striatal e pode ser deletéri…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde NIGMS 056062.
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL) | Sigma-Aldrich | M0896 | for PD modeling | |
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA) | American MasterTech Scientific | BUP0157 | for immersion fixation | |
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA) | Sigma-Aldrich | 244252 | for HPLC acid extraction | |
Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | for tissue homogenization | |
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E1644 | for tissue homogenization | |
Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | for tissue homogenization | |
Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P5726 | for tissue homogenization | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | for Lowry protein assay | |
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389 | for cryoprotection | |
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | for IHC | |
BCA Protein Assay Kit | Pierce/Thermo | 23225 | for protein determination | |
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-well | Invitrogen/Life Technologies | EC60052BOX | for SDS-PAGE | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 | for SDS-PAGE | |
Novex Sharp Prestained Protein Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5800 | protein ladder | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for SDS-PAGE | |
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | for SDS-PAGE | |
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent | American MasterTech Scientific | SPM1057C | methanol for transfer | |
Sodium chloride (NaCl), ACS reagent | Sigma-Aldrich | S9888 | saline and buffers | |
Nonfat dry milk powder | Carnation | n/a | for immunoblotting | |
Ponceau S solution in 5% acetic acid | Sigma-Aldrich | P7170 | for immunoblotting | |
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonal | Chemicon/Millipore | AB1542 | for immunofluorescence | |
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonal | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | for immunoblotting | |
Anti-β Actin, rabbit | Sigma-Aldrich | A2066 | for immunoblotting | |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonal | Chemicon/Millipore | AB5804 | for immunofluorescence | |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonal | Covance Inc. | SMI-22R | for immunoblotting | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | for immunoblotting | |
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated | Fisher Scientific | 31462 | for immunofluorescence | |
goat anti-sheep, peroxidase conjugated | Pierce/Thermo | 31480 | for immunofluorescence | |
goat anti-mouse, peroxidase conjugated | Pierce/Thermo | 31430 | for immunofluorescence | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Pierce/Thermo | 34078 | for immunoblotting | |
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in | Pierce/Thermo | 34089 | for immunoblotting | |
Restore Western Blot Stripping Buffer | Pierce/Thermo | 21059 | for immunoblotting | |
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | C1909 | for IHC | |
Normal Donkey Serum | Millipore | S30-100ML | for IHC | |
Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Sigma-Aldrich | P5288 | for IHC | |
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized | Sigma-Aldrich | A3294 | for IHC | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-01 | for IHC | |
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled | Invitrogen/Life Technologies | A10042 | for IHC | |
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC | Jackson ImmunoResearch | 713-095-147 | for IHC | |
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | for IHC | |
Normal Goat Serum | Millipore | S26-100ML | for IHC | |
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG ) | Vector Laboratories | PK-4001 | for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions ) | |
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidine | Vector Laboratories | SK-4100 | for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use) | |
Hydrogen peroxide, 30% | Sigma-Aldrich | 216763 | for quench step in IHC | |
Rabbit anti-Iba1 | Biocare Medicals | CP290A | for IHC | |
Cresyl Violet Solution, Regular Strength | FD Neurotechnologies | PS102-01 | counterstain for Iba1 IHC | |
95% Ethanol, reagent alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | dehydration for IHC | |
100% Absolute ethanol | Mallinckrodt | 7019-10 | dehydration for IHC | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | destaining for IHC | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | clearing agent for IHC | |
DPX Mountant | Sigma-Aldrich | 06522 | mounting medium for DAB IHC | |
O.C.T. Compound – Frozen Section Embedding Medium | American MasterTech Scientific | EMOCTCS | embeddium medium for cryostat cutting | |
Potassium permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | to decontaminate DAB solution | |
Dopamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H8502 | for HPLC | |
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) | Sigma-Aldrich | 850217 | for HPLC | |
Homovanillic acid (HVA) | Sigma-Aldrich | H1252 | for HPLC | |
Perchloric acid (PCA) – 70% | Sigma-Aldrich | 244252 | for HPLC | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Sigma-Aldrich | 71504 | for HPLC | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | for HPLC | |
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA) | Sigma-Aldrich | O8380 | for HPLC | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | for HPLC | |
Acetonitrile | EMD | AX0145-1 | for HPLC | |
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O) | Millipore | for HPLC | ||
0.22 µm GSTF membrane | Millipore | for filtration | ||
Corning Netwells | Sigma-Aldrich | CLS3477 | polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC | |
[header] | ||||
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150) | MSE | MSE.41371.274 | ||
Microcentrifuge | Eppendorf | 5414R | ||
ESA MD-150 reverse-phase column | ESA | |||
HPLC Pump (Ultimate 3000) | Dionex | ISO-3100BM | ||
HPLC Autosampler (Ultimate 3000) | Dionex | WPS-3000TSL | ||
Electrochemical detector | ESA | Coulochem III | ||
Guard Cell | ESA | 5020 | ||
Analytical Cell | ESA | 5011A | ||
Chromeleon software | Dionex | |||
Eclipse E400 | Nikon | E400 | light/fluorescent microscope | |
Disposable mouse cage | Ancare | N10HT | ||
Microfilter top | Ancare | N10MBT | ||
[header] | ||||
5-LOX- deficient mice | The Jackson Laboratory | 004155 | ||
12/15-LOX-deficient mice | The Jackson Laboratory | 002778 |