Method Article

파킨슨 병에서 감수성 메커니즘을 마스크를 해제하는 유전자 환경 상호 작용 모델

DOI:

10.3791/50960

⸱

January 7th, 2014

 ,  ,  , 
1Center for Health Sciences, SRI International, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California-Santa Cruz

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipoxygenase (LOX) isozymes 증가 또는 증가 시킬 수 있는 제품을 생성할 수 있습니다 또는 신경 염증 및 신경 변성. 유전자 환경 상호 작용 연구 LOX isozyme 특이적 효과 식별할 수 있습니다. 두 개의 LOX isozyme-결핍 형 형질 라인에서 니그로스트리아탈 손상의 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 모델을 사용하면 도파미너기크 및 염증에 대한 LOX 이소지메의 기여도를 비교할 수 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipoxygenase (LOX) 활동은 알츠하이머 병과 같은 신경 퇴행성 질환에 연루되었지만 파킨슨 병 (PD) 병기 발생에 미치는 영향은 덜 이해됩니다. 유전자 환경 상호 작용 모델은 단독으로 유전 적 또는 독성 질병 모델을 사용하여 관찰되지 않을 수 있는 독성에 있는 특정 세포 통로의 충격을 마스킹해제에 있는 유틸리티가 있습니다. 뚜렷한 LOX 이소지메스가 PD 관련 신경변성에 선택적으로 기여하는지 평가하기 위해,형질전환(즉, 5-LOX 및 12/15-LOX 결핍) 마우스는 장애에서 세포 손상과 사망을 모방한 독소로 도전할 수 있다. 여기서 우리는 PD와 관련된 신경 변성에 LOX isozymes의 뚜렷한 기여를 해명하기 위해 nigrostriatal 병변을 생성하는 신경 독소, 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6 테트라 하이드로피리딘 (MPTP)의 사용을 설명합니다. 마우스에 MPTP의 사용, 비 인간 영장류, PD의 nigrostriatal 손상을 재현하기 위해 잘 설립된다. MPTP 유도 병변의 정도는 도파민의 HPLC 분석과 대사산물 및 티로신 하이드록실라제(TH)에 대한 스트리에이텀의 반정성 서양 얼룩 분석에 의해 측정되며, 도파민합성을 위한 속도 제한 효소이다. LOX 이소지메 선택적 감도를 입증할 수 있는 염증성 마커를 평가하기 위해, 글리아 세동 산성 단백질(GFAP) 및 이바-1 면역조직화학은 실질적인 니그라를 함유하는 뇌 단면에서 수행되며, GFAP 웨스턴 블롯 분석은 현저균질상에서 수행된다. 이 실험적인 접근은 nigrostriatal 변성 및 PD의 근본적인 유전자 환경 상호 작용에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유전자 환경 상호 작용 모델의 사용은 특발성 파킨슨 병 (PD)에 영향을 미칠 가능성이 있는 위험 요소를 모방하는 접근법을 제공하고 유전적 또는 독성 시스템만1,2를사용하여 해명될 가능성이 없는 기계론적 통찰력을 분별할 수 있는 기회를 제공한다. 여기서 우리는 이 점을 설명하고 신경염증 및독성에대한 립산소증(LOX)의 선택성을 더 잘 이해하기 위해 니그로스트리아탈 변성3의 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 마우스 모델의 적용을 설명한다. LOX isozymes에 대한 역할은 뇌졸중7 및 알츠하이머 병8,9를포함한 CNS 질환뿐만 아니라 말초 장애5,6에서 널리 평가되었지만, PD와 관련된 니그로스 트리아탈 기능 및 변성에서 이소지메의 가족의 역할은 잘 이해되지 않고 연구를 보증한다. MPTP 신경독소는 니그로스트리아탈 통로의 우대변성을 입증하고 PD환자(10)의운동장애를 뒷받침하는 스트루아탈 도파민 고갈 및 니그랄 도파민 세포 손실을 재구성한다. 이 모델은 비운동 및 모터 PD 행동과 솔직한 α-synuclein 양성 Lewy 신체 병리학의 전체 간부를 재현하지는 않지만, 111에 의해 안정적으로 nigral cell death....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고: 모든 동물 절차 및 동물 관리 방법은 기관의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받아야 합니다. 여기에서 기술된 연구는 SRI 인터내셔널의 IACUC에 의해 수립된 지침에 따라 수행되었습니다.

1. LOX 결핍 마우스의 획득 및 유지 보수

  1. 5-LOX 결핍 또는 12/15-LOX-결핍 마우스와 7-8 주에 각각의 변형 및 성일치 제어를 구입하고 도착 후 시설에 적응하기 위해 며칠을 허용하십시오.
  2. 12-h 밝은 어두운 주기에 그룹 하우징에서 마우스를 유지하고 음식과 식수 광고 리비툼을제공합니다.

2. MPTP 예방 조치, 저장, 준비, 오염 제거 및 폐기

참고: 인간에 있는 정맥 노출에서 MPTP 중독은 파킨슨증을 일으키는 원인이 되기 위하여 보였습니다10; MPTP는 매우 지평성이며 혈액 뇌 장벽(26)을쉽게 교차 할 수 있습니다. 안전한 취급, 해독 및 폐기를 보장하기 위해 예방 조치를 취해야 합니다. 그것의 물질 대사는 효....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 독소 노출 패러다임은 MPTP- 대 식염수 주입 동물에서 중요하고 검출 가능한 20% 현저도 도파민 고갈을 생성할 수 있습니다. MPTP의 다른 제비는 약간 더 많거나 적은 병변을 얻을 수 있다는 것을 주의하는 것이 중요합니다; 따라서, 더 나은 정밀도를 위해, 신경 독소의 새로운 제비가 이용될 때 형질전환에서 사용하기 전에 야생형 마우스에 있는 예비 실험은 추천됩니다. 온화한 병변의 사용은 간질이 관찰될 수 있는 질유전자의 충격을 허용합니다; 심한 병변은 해로운 유전 적 변화의 효과를 가리기 위해 감쇠 또는 너무 손상에 너무 강력한 부상으로 '바닥 효과'를 생성 할 수 있습니다. TTP가 현저도 도파민에 미치는 영향은 5-LOX 이소지메 결핍 마우스에서 크게 달랐지만, 12/15-LOX 이소지메-결핍마우스(도 1)는아니었다. 더욱이, 이러한 방법으로, 우리는 식염수 처리 마우스의 5-LOX 결핍으로 인해 도파민 수준에 상당한 차이를 분별 할 수 있었다(도 1).<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 유전자 환경 상호 작용 연구의 디자인은 우리가 nigrostriatal 통로에 있는 5-LOX isozyme의 이중 본질에 관하여 새로운 정보를 얻기 위하여 허용했습니다. 5-LOX 이소지메와 그들의 야생형 쓰레기메이트가 결핍된 형질 성 전환기에서 식염수 또는 MPTP 처리 후에 striatal monoamines를 측정하기 위하여 HPLC를 수행해서, 우리는 그것의 결핍이 독성 조건하에서 보호되는 것처럼 보인다는 것을 주의할 수 있었습니다(그림 1),그러나 일반적인 조건하에서, 효소의 부족은 striatal 도파민 수준을 감소시키고 삭제될 수 있습니다. 따라서, 우리는 5-LOX isozyme정상 조건하에서 striatal dopaminergic 음색에 기여한다는 것을 증명할 수 있습니다, 그러나 독성 도전4다음손상에 기여할 수 있습니다.

추가 평가는 NIGrostriatal 독성에서 LOX isozymes의 역할에 새로운 .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

공개할 것은 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 건강 NIGMS 056062의 국가 학회에 의해 투자되었다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라-하이드로피리딘 하이드로클로라이드(MPTP-HCL)PD 모델링용시그마-알드리치M0896
4% 포름알데히드(파라포름알데히드) 용액, 인산염 완충(PFA)침지 고정을 위한American MasterTech ScientificBUP0157
과염소산 ACS 시약, 70%(PCA)HPLC 산 추출
을 위한 시그마-알드리치 244252조직균질화를 위한시그마-알드리치T1503
에틸렌디아미노테트라아세트산이나트륨염 이수화물(EDTA)조직 균질화를 위한시그마-알드리치E1644
프로테아제 억제제 칵테일균질화를 위한시그마-알드리치P8340
인산가수분해효소 억제제 칵테일시그마-알드리치P5726균질화를 위한
수산화나트륨(NaOH)Sigma-AldrichS5881Lowry 단백질 분석용
자당, 분자 생물학, ≥ 99.5%(GC) Sigma-AldrichS0389동결 보호
인산염 완충 식염수, 분말, pH 7.4 (0.01 M PBS의 경우)Sigma-AldrichP3813IHC
BCA 단백질 분석 키트Pierce/Thermo23225단백질 측정용
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-wellInvitrogen/Life TechnologiesEC60052BOXSDS-PAGE
NuPAGE LDS 시료 SDS-PAGEInvitrogen/Life TechnologiesNP0007
 Invitrogen/Life TechnologiesLC5800단백질 사다리
글리신시그마-알드리치G7126SDS-PAGE
소듐 도데실 설페이트, 전기영동, 98.5% (SDS)Sigma-AldrichL3771SDS-PAGE
메틸 알코올, 무수, 시약 American MasterTech ScientificSPM1057C전달용 메탄올
, ACS 시약Sigma-AldrichS9888식염수 및 완충액
무지방 분유 분말Carnationn/a면역 블로팅
Ponceau S 용액 5% 아세트산 블로팅을 위한Sigma-AldrichP7170
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), 양 polyclonalChemicon/MilliporeAB1542를 위한 면역형광 
안티-티로신 하이드록실라제(TH), 토끼 다클론Pel-Freez BiologicalsP40101-0면역 블로팅
항-&베타; Actin, 면역블로팅Sigma-AldrichA2066
용토끼 다클론Chemicon/MilliporeAB5804
, 마우스 단클론Covance Inc.SMI-22R
Tween-20Sigma-AldrichP1379를 면역 블로팅하는
염소 Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated를Fisher Scientific31462형
염소 항양, 과산화효소 접합Pierce/Thermo31480면역
염소 항마우스, 과산화효소 접합Pierce/Thermo31430형광
SuperSignal West Pico 화학발광 기판Pierce/Thermo34078블로팅
CL-XPosure 필름 7 인치 x 9.5 인치 면역 블로팅을 위한Pierce/Thermo34089
복원 웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼 블로팅을 위한Pierce/Thermo21059
구연산 일수화물, ACS 시약, ≥ 99.0% 그마-알드리치C1909IHC
노멀 당나귀 혈청밀리포어S30-100ML
IHC 폴리비닐피롤리돈(PVP)시그마-알드리치P5288IHC
소 혈청 알부민(BSA), 동결건조시그마-알드리치A3294IHC
트리톤 X-100피셔 사이언티픽BP151-01IHC
당나귀 안티-래빗 IgG, 알렉사 플루오르 568-라벨;Invitrogen/Life TechnologiesA10042IHC
당나귀 안티-양 IgG (H+L), FITC Jackson ImmunoResearch713-095-147for IHC
VECTASHIELD 하드-세트 마운팅 미디엄 DAPIVector LaboratoriesH-1500for IHC
Normal Goat SerumMilliporeS26-100MLfor IHC
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG ) IHC용 Vector LaboratoriesPK-4001; 10 &마이크로; l 1ml PBS 당 용액 A 및 B (지침 당)
DAB Peroxidase Substrate Kit, IHC 용 3,3'-diaminobenzidineVector LaboratoriesSK-4100; 5ml 콜드 ddH2O 당 2 방울 버퍼 스톡 용액, 2 방울 DAB 및 1 드롭 H2O2 (H2 O2 사용 직전에 바로 추가)
과산화수소, 30%Sigma-Aldrich216763IHC
Rabbit anti-Iba1Biocare MedicalsCP290A에서
Cresyl Violet Solution, Regular Strength FD NeurotechnologiesPS102-01Iba1 IHC
95% 에탄올, 시약 알코올Sigma-AldrichR8382IHC
100% 절대 에탄올Mallinckrodt7019-10IHC
아세트산Sigma-AldrichA6283탈수 IHC
XyleneSigma-Aldrich534056투명화 IHC
DPX 마운트Sigma-Aldrich06522마운팅 매체, DAB IHC
O.C.T. 컴파운드 - 냉동 섹션 임베딩 매체용 American MasterTech ScientificEMOCTCS저온 유지 절단 용 EMOCTCS embeddium 배지
과망간산 칼륨 과망간산 칼그마-알드리치223468DAB 용액
도파민 염산염시그마 알드리치H8502HPLC
3,4-디하이드록시페닐아세트산(DOPAC)시그마-알드리치850217
HPLC 호모바닐산(HVA)용 시그마-알드리치HPLCH1252
- 70%HPLC
나트륨 인산이수소 일수화물시그마-알드리치 244252 HPLC71504
HPLC용시그마-알드리치C1909
1-옥탄술폰산 나트륨 염(OSA)HPLC용시그마-알드리치O8380
EDTA시그마-알드리치E1644
HPLC 아세토니트릴EMDAX0145-1HPLC
등급 탈이온수(ddH2O)HPLC 0.22밀리포어
; m GSTF 멤브레인Millipore여과용
Corning NetwellsSigma-Aldrich CLS3477폴리스티렌 인서트와 폴리에스터 메시 바닥, IHC
초음파 세포 파괴자용 (Soniprep 150)MSEMSE.41371.274
마이크로 원심분리기Eppendorf5414R
ESA MD-150 역상 컬럼 ESA
HPLC 펌프(Ultimate 3000)DionexISO-3100BM
HPLC 자동시료주입기(Ultimate 3000)DionexWPS-3000TSL
전기화학 검출기ESACoulochem III
Guard CellESA5020
Analytical Cell, ESA5011A,
Chromeleon 소프트웨어Dionex
Eclipse E400NikonE400광/형광 현미경
일회용 마우스 케이지AncareN10HT
마이크로 필터 상단AncareN10MBT
5-LOX 결핍 마우스The Jackson Laboratory004155
12/15-LOX 결핍 마우스The Jackson Laboratory002778
트리스 베이스 조직 조직 Novex Sharp Prestained Protein Standard용 버퍼 (4x) 염화나트륨 (NaCl) 면역 , Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein(GFAP)용 토끼 , 면역형광 Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein(GFAP)은 위한 것입니다. 면역광 형광 면역 면역면역 시용 담금질 단계를 위한 IHC 탈수 륨 오염 제거 시용 과염소산(PCA)용 시그마-알드리치 용 구연산 일수화물용 시그마-알드리치 µ용 ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Manning-Bog, A. B., Langston, J. W. Model fusion, the next phase in developing animal models for Parkinson's disease. Neurotox. Res. 11, 219-240 (2007).
  2. Vance, J. M., Ali, S., Bradley, W. G., Singer, C., Di Monte, D. A. Gene-environment intera....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gene Environment InteractionParkinson Disease ModelsLipoxygenase IsozymesMPTP Neurotoxin ChallengeDopamine Level AnalysisWestern Blot AnalysisImmunohistochemistry StainingTyrosine Hydroxylase DetectionGlial Fibrillary Acidic ProteinIba 1 Immunohistochemistry

Related Articles