自由游泳弱电鱼的长期行为跟踪
Summary
我们描述了一组技术研究的自由游动弱电鱼在较长的时间内，通过同步测量动物的电子琴放电时间，体位和姿势既准确，可靠地在一个专门设计的水族箱内感官自发行为隔离室。
Abstract
长期行为跟踪可以捕获和量化自然动物的行为，包括那些不经常发生。行为，如勘探和社会交往能得到最好的研究通过观察奔放，自由活动的动物。弱电鱼（WEF）的显示屏很容易观察到探索性和社会行为所散发电子琴放电（EOD）。在这里，我们描述了三个有效的技术来同步测量排爆，身体姿势，以及一个自由游动的世界经济论坛为长时间的姿势。首先，我们描述了一个实验箱的结构的隔室旨在阻止感官刺激如光，声音和振动的外部源的内部。水族馆分配，以容纳四个测试样本，并自动闸门远程控制动物的访问中央舞台。其次，我们从自由游泳世界经济论坛描述准确，可靠的实时排爆定时测量方法。引起动物的身体运动的信号失真是通过空间平均和瞬时处理阶段修正。第三，我们描述了一个水下近红外成像的设置来观察泰然自若夜行性动物的行为。红外光脉冲被用来在一个较长的记录时间同步的视频和生理信号之间的定时。我们的自动跟踪软件测量动物的身体位置和姿势可靠地在水上的场景。在组合中，这些技术可实现长期观察的可靠和精确的方式可自由游动弱电鱼自发行为。我们相信，我们的方法可以通过探索性或社会行为与他们的生理信号同样适用于其他水生动物的研究。
Introduction
背景 。对动物行为的定量实验（ 如被迫的选择，避免震动，T-迷宫等 ）通常用于调查有关的感觉运动技能，学习和记忆的形成特定的假设。然而，这些限制性实验错过很多自然动物行为的丰富性，并有可能导致行为的潜在的神经基础的过于简单的模型。因此，更多的自然条件下的实验是由我们可以探索更充分地一个物种的行为习惯的重要补充。涉及自由移动的动物实验，但必须满足独特的技术挑战，如运动诱发的记录文物。不像刺激诱发反应，自发产生的探索行为是无法预测的，因此实验对象必须不断监测和跟踪在一段较长的时间。具体的研究问题的CAN为最好由精心挑选的生物体和可用的技术工具解决。例如，如基因编码的钙传感器1和光遗传学2光学记录和刺激技术已成功地应用于自由移动的遗传模式生物3-5。另外，小型化神经遥测系统可以记录和刺激自由活动小动物6,7。
电鱼 。世界经济论坛的物种产生电子琴放电（EODS），这让他们感觉到他们的周围环境或在更远的距离进行通信。 EODS的时间模式不同的条件，例如自我运动8,9，感官刺激10,11，和社会交往12,13下有所不同。脉冲型WEF物种产生离散的脉冲串，而不是其产生连续的准正弦波波型物种。一般情况下，脉冲型品种表现出铁道部Ë可变排爆率相比，波浪型的物种，以及动物的排爆率密切地反映他们的感官环境10,14的新奇内容。脉冲型物种可以立即在一个脉冲周期中响应缩短脉冲间的时间间隔（IPI），以一种新颖的感官扰 动（新颖响应10,11,14）。这些鱼的不断电的行为可以通过从外部来源不受控制的感官刺激的扰动，以及不同类型的刺激，如振动，声，电，光被称为触发新奇的反应。因此，特别注意必须采取在一个长期观察的自由游动的世界经济论坛，以阻止或减弱外界感官刺激。以这种方式，改变EOD速率和运动轨迹可以被指定属于由实验者呈现的刺激。
水族箱和隔离室 ，因此， 我们放置的振动吸收材料的多层üNDER大型水族箱（2.1米×2.1米×0.3米），并包围了罐隔热的外壳挡住光，电噪声，声音和热通量的外部来源。排爆速率取决于环境温度15,16，因此水温严格调控在一个热带范围内（25±1℃）南美世界经济论坛的物种。我们构建了一个大而浅（10厘米水深）水箱，观察世界经济论坛的空间探索行为主要局限于在两个维度（ 图1A）。罐被分隔成中央舞台观察空间的行为，以及四个角室分别容纳个别鱼（ 图1B）。每个隔间建防水，以防止个人之间的电气连通。动物进入中央舞台从外面由四个电动门被控制。门被放置在车厢之间，他们成为水密锁定时由尼龙翼螺母。无金属部件被用于水下自WEF反应灵敏金属。
排爆记录 。在刻板的方式通过激活单（在Mormyrids）或多个空间分布的电动器官（在Gymnotiforms）17,18产生EODS。在排爆率的时间调制可以揭示更高层次的神经活动，因为延髓起搏器接收到来自更高的脑区，如间脑prepacemaker细胞核，从而接收来自前脑轴索19直接推算神经的投入。然而，在EOD定时必须小心地从原始波形记录中提取，而不是由动物的运动诱发的扭曲偏置。由WEF产生的电场可以近似为一个偶极子，因此EOD脉冲振幅在记录电极依赖于动物和电极8,20之间的相对距离和方向。动物的自我MOVEM已废除改变相对几何关系的动物并在电极之间，从而变动引起的EOD的振幅在不同的电极，以随时间变化的易失性地（参见图2B中君等人 8）。此外，自变动，改变记录的EOD的波形的形状，因为来自不同组的电动机构的相对贡献取决于它们的位置沿所述主体的长度和它们的局部曲率由尾部的弯曲引入。在EOD幅度和形状的运动引起的失真会导致不准确和不可靠的排爆定时测量。我们克服这些问题，通过空间平均记录在不同位置的多个EOD的波形，并通过添加一个包络提取滤波器，以精确地确定从自由游动WEF的EOD定时。此外，我们的技术还测量EOD振幅，这表明动物是否是休息或积极地移动的基础上，EOD的变化振幅随着时间的推移（ 见图2E和2F）。我们记录了差分放大信号从记录电极对，以减少共模噪声。因为在不规则的时间间隔产生的脉冲排爆，排爆事件的时间序列具有可变采样率。在EOD时间序列可以通过内插，如果需要通过所选择的分析工具被转换为一个恒定的采样速率。
视频录制 。虽然排爆记录可以监控动物的总变动活动，录像允许的动物的身体位置和姿势的直接测量。近红外（NIR）照明（λ= 800〜900 nm）的允许泰然自若目测的自由游泳的鱼21,22，因为WEFs是最活跃的在黑暗中，他们的眼睛是不近红外光谱23,24敏感。大多数数码成像传感器（ 如 CMOS或CCD），可以捕捉近红外光谱与wavelengt800-900纳米之间h不等，消除红外（IR）阻断滤波器25后。某些高端消费级网络摄像头提供了高清晰度，宽视角和良好的低光灵敏度，它可以产生的图像质量相当于或优于专业级红外摄像机可在更大的成本。此外，某些消费级网络摄像头捆绑在一起的录音软件，允许延长记录时间由没有质量损失压缩视频。大多数专业级摄像机与数字化信号的视频之间调整的时机提供时间同步TTL脉冲输出或TTL触发脉冲输入26，不过这个功能一般是没有的消费级网络摄像头。然而，视频记录和一个信号数字转换器之间的定时可以准确地匹配通过同时拍摄周期性地闪烁红外相机和信号数字化的LED。初始和最后的IR脉冲的定时可以用一个的两个时间刻度标记物，用于将所述视频帧号到信号数字化时间单元，反之亦然。
灯光及背景 。通过图像捕捉水可因光线反射在水面技术上的挑战。水面可以作为一面镜子来反映一个视觉场景上面的水，和模糊的视觉特征的水下，因此上面的水现场必须提供无特色，以防止视线干扰。以图像整体的水族馆，照相机需要被放置在水的上方，以及它应该在一个小的观察孔顶棚背后被隐藏，以防止其在水面上的反射。此外，水面可以产生刺眼和不均匀的照明，如果光源不正确投影。间接照明可实现均匀的亮度在整个水族箱通过瞄准光源朝向天花板，这样，天花板和周围沃尔LS可以反映和到达水面之前弥漫的光线。选择一个红外照明相匹配的相机（ 如 850纳米峰值波长）的光谱响应。来自光源的电噪声可以通过使用LED灯，并把它们的DC电源的法拉第笼的外侧被最小化。放置一个白色的背景油箱下方，因为鱼的对比以及在一个白色的背景在近红外波长。同样，隔离室的内表面上使用的亚光白色可提供均匀，明亮的背景照明。
视频跟踪 。视频录制完成后，自动图像跟踪算法可以测量一段时间内动物的身体位置和姿势。该视频跟踪可以通过现成使用的软件（观点或Ethovision），或用户可编程软件（基于OpenCV或MATLAB 图像处理工具箱 ）自动执行。由于图像跟踪的第一步，一个有效的跟踪区域需要通过绘制几何形状外排除的区域（屏蔽操作）来定义。接着，动物的图像需要从背景中通过从含有该动物的图像中减去背景图像来进行分离。该减影图像是通过将强度阈值，从而使得质心和所述定向轴线可以从二值形态学运算来计算转换为二进制格式。在Gymnotiforms 27-29和30-32 Mormyrids的electroreceptor密度最高的头部区域附近，因此在任何时刻的头部位置表示最高感官敏锐度的位置。头部和尾部的位置可以通过将图像旋转和边界框的操作被自动地确定。头部和尾部末端可以彼此通过手动定义它们在第一帧中，并通过跟踪它们的位置从比较两个连续帧区别开来。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们的技术意义。综上所述，我们首先描述一个大水族箱的建设和隔离室观察世界经济论坛所产生的自发的探索行为。接下来，我们展示了记录和跟踪EOD率和从无节制的鱼使用多个电极对的运动状态进行实时的技术。最后，我们描述了在时间同步的方式，通过水的红外视频记录技术，图像跟踪算法来测量身体的位置和姿势。作为实验的准备，世界经济论坛提供了通过展示容易量化的排爆率…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由慷慨的加拿大自然科学和工程研究理事会（NSERC）和健康研究加拿大学院（CIHR）的支持。
Materials
| [Aquarium construction] | |||
| Electrically shielded floor heater | ThermoSoft Corp., IL, USA | ThermoTile | www.thermosoft.com |
| Tempered glass panel | generic | .5 inch thick, used for the aquarium construction | |
| Aquarium grade silicone | generic | ||
| Acrylic sheet | generic | .25 inch thick, matt white | |
| Natural rubber sheet | generic | .25 inch thick | |
| Servomotor | HITECHRCD Inc., Korea | HS-325HB, 180deg rotation | www.servocity.com |
| Servomotor arm mount | HITECHRCD Inc., Korea | 56362 Large Spline | www.servocity.com |
| Servomotor controller (6 chan.) | sparkfun.com | ROB-09664 | Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller |
| Active USB extension cable | C2G | 38990 | 12m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable |
| Exhaust fan | Nutone | ILFK120 | www.homedepot.com |
| Vertical aquarium filter | Tetra, Germany | Whisper Internal Power Filter – 40i | |
| Crushed coral | Used to increase the pH of the tank water | ||
| [EOD recording setup] | |||
| Graphite Electrodes | Staedtler, Germany | Mars Carbon 2-mm type HB | Shave the outer coating |
| Physiological Amplifier/Filter | Intronix, Canada | 2015F | |
| Coaxial Cable | generic | RG174 | For electrodes assembly |
| Coaxial Cable | generic | RG54 | For wiring use |
| BNC jack connector for RG-174 | Amphenol Connex | 112160 | For electrodes assembly |
| BNC plug connector for RG-54 | Amphenol Connex | 112116 | For wiring use |
| Signal digitizer hardware | Cambridge Electronic Design, UK | Power MKII 1401 | |
| Signal digitizer software | Cambridge Electronic Design, UK | Spike 2. ver 7 | |
| [Visual tracking setup] | |||
| White LED light | IKEA, Sweden | DIODER 201.194.18 | www.ikea.com |
| Infrared LED light (850 nm) | Scene Electronics, China | S8100-60-B/C-IR | Remove built-in fan |
| USB webcam | Logitech Inc., CA, USA | C910 | Remove Infrared blocking filter |
| Motorized camera | Logitech Inc., CA, USA | Quickcam Orbit | Remove Infrared blocking filter |
| Video recording software | Logitech Inc., CA, USA | Logitech Quickcam Software | Download from www.logitech.com |
| Matlab | Mathworks, MA, USA | 2012a | Image processing toolbox |
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