왁스 나방 갤러리아 mellonella의 유충은 최근 레지오넬라 뉴모 감염을 연구하는 생체 내 모델로 설립되었습니다. 여기, 우리는 예방 접종, 세균 독성 및 복제의 측정뿐만 아니라 감염된 혈구 세포의 추출 및 분석을 포함하여 유충에서 레지오넬라 균의 발병을 특징 짓는 기본적인 기술을 보여줍니다.
레지오넬라 뉴모 필라는 레지오넬라 병이라는 중증 폐렴의 원인이되는 에이전트는 감염과 폐포 대 식세포 내 복제 중요한 인간 병원체입니다. 그 독성은 공포 (LCV)를 포함하는 레지오넬라 균으로 알려진 복제 허용하는 공포를 구축하는 것이 필수적입니다 점 / ICM 타입 IV 분비 시스템 (T4SS)에 따라 달라집니다. L.을 뉴모 감염 그러나 대부분의 마우스 종자가 새로운 감염 모델에 대한 검색에 이르는, 관대하지 않은 생쥐에서 모델링 할 수 있습니다. 우리는 최근에 왁스 나방 갤러리아 mellonella의 애벌레는 L.의 조사에 적합한 것으로 나타났습니다 뉴모 감염. G. mellonella 점점 인간의 병원체에 대한 감염의 모델로 사용하고 좋은 상관 관계는 곤충과 포유 동물 모델에서 여러 세균 종의 독성 사이에 존재한다. 애벌레의 면역 방어의 핵심 구성 요소는 혈구 세포, 직업입니다침략자를지고 파괴 알 식세포. L. 뉴모는 감염 LCV를 형성하고 이들 세포 내에서 복제 할 수있다. 여기에서 우리는 L. 분석을위한 프로토콜을 보여 G.에서 뉴모 독성 전염성 L.에게 성장하는 방법을 포함 mellonella 모델, 뉴모는 억제제 유충을 전처리 유충 감염 및 정량화 및 면역 형광 현미경에 감염된 세포를 추출하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 또한 경쟁 분석에 박테리아 복제 및 체력을 정량화하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 접근법은 L. 중요한 요소를 결정하는 돌연변이의 신속한 선별을 허용 이 복잡한 병원체에 대한 우리의 이해를 돕기 위해 새로운 도구를 설명 뉴모 독성.
감염 동물 모델은 박테리아 독성 요인의 판정에 귀중한 입증되었다. 그러나, 무척추 동물 모델은 감염의 기존의 포유 동물 모델에 대한 실행 가능한 대안으로 증가 된 관심을 얻고있다. 왁스 나방의 유충은, 갤러리아 mellonella 점점 1 그람 양성과 그람 음성 세균 2,3 여러 병원성 곰팡이 4,5 등의 중요한 인간 병원균의 숫자를 연구하는 데 사용하고있다. 곤충 모델을 사용 무척추, G. 등, 기존의 포유 동물 모델에 비해 많은 장점을 가지고 mellonella 포유 동물 모델의 윤리적 제한이 적용되지 않습니다. 또한, 유충은 쉽게 유지 될 수 마취없이 주사로 감염, 화학 억제제 6 전처리를 거쳐 37 ° C에서 7시에 배양을 유지. 흥미롭게도, G. 여러 미생물의 병원성 사이의 상관 관계 멜lonella 감염의 포유 동물 모델 2.8을 설립되었습니다. G.의 면역계의 증가 이해 mellonella는이 모델 생물의 특성에 도움을주었습니다. 포유 동물에서 볼 수있는 곤충 적응 면역 체계를 가지고 있지 않지만, 그들은 항균 펩티드 (9)의 생산을 포함하여 정교한 세포 및 상완골 방어를하지 않아도됩니다. 혈구 세포는 세포 방어의 주요 매개체하고 있습니다 G.의 체액 (혈액)에서 발견 된 가장 많은 세포 유형 mellonella 10,이 세포는 전문 식세포하고 모두가 복용하고 phago – 리소좀 구획 10, 11에서 박테리아를 분해하고 박테리아 침입 주위에 결절을 형성, 물리적으로 박테리아 복제 (12)를 제한함으로써 인간 대 식세포 및 호중구 유사한 기능을 수행합니다.
레지오넬라 뉴모 필라 심각한 pneumoni을 일으키는 호흡기 병원체이러한 노인 또는 13 면역 등 취약 인구 (레지오넬라 병). 레지오넬라 균이 신선 물 아메바 (14, 15)의 다양한 종의 병원체 환경과 인공 모두 수원에서 보편적으로 발견된다. 레지오넬라 균이 살아남아 숙주 세포 16-20으로 275 이상의 이펙터 단백질을 이동시키다하는 4 분비 시스템 (T4SS)를 입력 도트 / ICM (세포 기관의 매매에 결함 / 세포 증식)로 알려진 다중 단백질 복합체를 이용하여 이러한 전문 식세포 내에서 복제합니다. 이 단백질은 공포 (LCV)를 포함하는 레지오넬라 균의 생성에 이르는, 정상적인 숙주 세포의 식세포 경로를 파괴하는 역할을한다. LCV는 리소좀과 융합을 방지하고 대신 소포체을 모집 (ER) 거친 ER 21, 22과 유사한 전문 구획의 결과로, 소포를 파생. L.는 뉴모은 우발적 인 인간의 경로로 간주됩니다ogen 그것은 아메바에서 복제 할 수 같은 전략은 또한 인간의 폐포 대 식세포 (23)의 복제를 할 수 있습니다.
포유류의 호스트는 마우스와 기니아 피그 (24, 25)을 포함하여 인간의 레지오넬라 균 감염에 대한 모델로 특성화되었다. 그러나, 마우스 균주의 대부분은 가벼운 자기 – 제한적 감염 24 개발 근친 변종 A / J 마우스를 제외 레지오넬라 감염 (26)에 저항한다. 기니 피그 모델은 더 밀접하게 인간의 질병 (25), 돌연변이의 부족을 닮아 비용 증가는 사용을 권장하지 않지만 27. 또한, 여러 무척추 동물 모델 Caenorhabditis의 28 엘레 간스 등의 레지오넬라 뉴모 필라 감염 개발 된 초파리는 29 melanogaster의 여러 종 아메바 30-32의. 그러나 이러한 모델은 C. 약점, 독성이 엘레 </em> 시스템은이 모델의 유용성을 제한, 28 점 / ICM에 의존하지 않습니다. 초파리 모델은 세균의 독성이 29 요소와 그러나 유망한 것으로 나타납니다 조사에 효과가 입증되었다,이 모델은 완전히 특징되지 않았습니다. 단세포 아메바는 L.의 환경 호스트입니다 뉴모 및 분자 수준에서 33 독성 인자의 작용을 조사하기에 이상적이다 그러나 같은 카스파 제 (34)와 같은 감염 포유 동물 숙주 세포 반응의 몇몇 중요한 매개체 부족하다. 포유 동물 실험에 관련된 높은 비용과 윤리적 인 문제와 함께 기존 모델의 약점은 다른 적절한 모델 생물 29,35에 대한 검색되었다.
우리는 최근에 보여준 그 G. mellonella는 L.에 적합한 모델입니다 뉴모는 (36, 37)를 발병. 이 프로토콜은 감염에 사용되는 실험 기술의 자세한 사항G.를 보내고 mellonella의 유충, 애벌레 도덕성을 분석 계산과 면역을위한 혈구 세포를 추출 가능한 CFU로 복제를 결정하는 감염된 유충에서 계산합니다.
레지오넬라 뉴모 감염 갤러리아 mellonella 애벌레 모델은 발병의 생체 연구를위한 유용한 도구입니다. 여기로는 대식구 감염 양태의 수가 G.에 효과적으로 요약 될 수 있음을 나타낸다 독성 박테리아 복제의 점 / ICM T4BSS의 역할과 점 / ICM 이펙터 SIDC의 지역화를 포함 mellonella 모델. 또한, 우리는 액틴의 중합 반응의 화학 억제제는 크게 macophages 47에서 얻어진 결과를 흉내 낸 박테리아의 내면화가 유충의 사망률을 일으킬 필요가 있다는 증거를 지원하고, 유충의 사망률을 감소 시킨다는 것을 보여줍니다. 이전에는 입증 된 그 L. 사이에 독성의 변화 다른 감염 모델에서 볼 뉴모 균주 G.에서 확인 할 수있다 mellonella 및 사후 기하 급수적 인 성장 단계에서 독성 인자의 유도가 세균의 독성이 필요합니다 <su확인 P> (36), 그 G. mellonella는 L.에 적합한 모델입니다 뉴모 감염.
L.의 CFU 결정 애벌레에서 뉴모은 단독 또는 혼합 감염에 크게 모델의 유틸리티가 증가 감염. 이전에는 여러 가지 요인이 감염 29,48-51의 하나 또는 그 이상의 모델에서 박테리아 복제에 미묘한 영향을 미칠 것을 발견되었다. 애벌레는 적응성 면역계를 가지고 있지 않지만, 선천성 면역 반응의 존재는 미묘한 표현형을 증폭하는 역할을 할 수있는 단독 식세포에 비해 강한 선택을 제공한다. 따라서 이러한 변종이 아마 상당히 유충의 사망률에 영향을 미치지 않습니다 동안, 그들은 G. 세균 복제의 적합성을 감소 입증 할 수 있습니다, 가능성이있다 mellonella 모델. 뿐만 아니라 L.의 복제 애벌레에서 뉴모 필라, 우리는 늦게 감염에 중요한 혈구의 고갈을 보여 주었다. L.로뉴모 또한 세균성 복제의 간접적 인 측정으로서 기능 할 수있다 혈구 고갈을 측정, 그 복제주기의 끝에서 숙주 세포를 용해 할 것으로 예상된다. 최근 결과이 사진은 처음 37을 믿었보다 더 복잡한 것을 제안하지만, 혈구 고갈 이전에 감염 3,52 곤충 사망률과 상관 관계가있다. 최근에는 애벌레의 기아는 면역 반응 (53)의 억제를 통해 감염에 대한 감수성을 증가에 이르게 것으로 나타났습니다. 여기에 설명 된 분석에서, 유충은 연구 기간 동안 공급되지 않았다 그것은 공급 애벌레 L.에 어떻게 반응 할 것인지를 잘 알 수 없습니다 뉴모 감염.
G. 하나의 장점 모델 생물로 mellonella 감염 유충에서 혈구 세포의 추출 및 정량의 용이성이다. 이전 동영상 그러나 만난 곤충 (54, 55)에서 추출하는 혈구 세포에 대한 다양한 방법을 보여 주었다HOD 여기에 제시된 즉각적인 처리를위한 간단하고 적당하다. 일단 추출, 혈구 세포는 쉽게 정량화 면역 형광, 투과 전자 현미경 (36)에 사용하거나 (56) 또는 배양 세포 계측법 흐름 및 감염 세포의 반응은 구체적으로 조사 될 수 있도록 생체 3에 감염 될 수있다. 이것은 상당히 모델의 유연성을 증가시킨다. G.에서 면역에 한 가지주의 할 점 mellonella는 G.에 대해 유효성을 검사 항체의 공급이 제한됩니다 mellonella 단백질. 그러나, 연구는 애벌레 단백질 57, 인간의 면역 관련 단백질에 대한 항체에 대한 항체의 생성을 증명하고있다는 G.를 인식하는 것으로 확인되었다 11 G. 면역 형광에 대한 가능성을 입증 mellonella 단백질 mellonella의 혈구 세포.
G.의 용이성 mellonella 감염은 할 수 빠르고, 중간 처리량 화면을 허용다양한 레지오넬라 종 및 균주의 병원성을 비교하는 데 사용될 더욱 그러한 부착 분자 (58) 또는 다른 모델에서 병독성에 필요한 유형이 분비 시스템 (59)과 같은 이전에 확인 된 독성 요인을 분석하는데 사용될 수있다. 또,이 모델의 사용은 분비 옭 효과기 단백질을 포함한 신규 한 독성 인자의 동정 및 특성화를 더욱 허용 할 것이다. 최근에는 L.의 포스 포 리파제 C 활동을 보여왔다 뉴모는 G.의 역할을 mellonella 독성 60, 즉 점 / ICM 이펙터 단백질 SdhA은 독성 (37)가 필요합니다. 또, 최근 G. 관찰 표현형 사이의 상관 관계가 있다는 것을 보여 주었다 mellonella 및 A / J 마우스 변형 37.
이 환경 원생 동물 및 단세포 호스트와 무리를 보완하기 위해이 도구의 가치를 강조NE 감염 모델. G. 애벌레 게놈 시퀀스는 사용할 수 많은 유전 적 도구가 설립되면 mellonella 모델은 미래에 더 많은 가치가 될 것입니다. 이 방향의 단계는 면역 관련 전 사체 (61)과 나비목 종 (62)에 유전자 침묵을 사전에 계획의 형성을 상세히 최근 게시 있습니다.
G.를 사용함으로써 mellonella 유충 제외한 L.의 발병 기전을 조사하기 위해 사용될 수있다 병원성 세균의 간단한 신속한 판독의 개수를 가지고 뉴모. 이러한 분석과 L.의 넓은 검사 설립 뉴모 긴장과 혈청군이 새로운 도구의 유틸리티를 증가하고 L.에 대한 우리의 이해에 기여할 것 뉴모 병인.
The authors have nothing to disclose.
CR 하딩은 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 학생이기의 WT086724에 의해 지원되었다.
Material/ Equipment | |||
ACES yeast extract (AYE) broth | 4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g α-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution* *add sterile ingredients after autoclaving |
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Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates | As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar | ||
Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate) | Sigma | P6526 | 0.6 mM solution, sterile filtered |
Sterile cysteine solution | Sigma | C7880 | 3.3 mM solution, sterile filtered |
G. mellonella (waxworms) | Livefood UK | W250 | |
Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC) | Sigma | H9037 | |
Anti-Legionella LPS | Cambridge Biosciences | PA1-7227 | |
Anti-Rabbit IgG Alexa488 | Jackson Immunoreach | 711-485-152 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS) | Sigma | D8662 | |
Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1026 | |
Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | |
Digitonin | Sigma | D141 | |
Cytochalasin D | Biomol International | BML-T109-0001 | |
[header] | |||
Material | |||
Microtiter Syringe | Sigma | 24544 | |
Cell counter, double, Improved Neubauer | VWR | 631-0926 | |
Centrifuge | For centrifuging plates | ||
Fluorescence microscope | Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores | ||
Inverted microscope | For viable cell counting | ||
Puncture-proof glove | Turtleskin |