Cellules de mammifères autonome bioluminescentes pour la surveillance continue et en temps réel de la cytotoxicité
Summary
Les cellules de mammifères exprimant la cassette du gène de bioluminescence bactérienne (<em> Lux</em>) Produire de la lumière de manière autonome. La dynamique bioluminescentes résultant lors de l'exposition chimique a été démontrée pour tenir compte des effets du traitement sur la croissance cellulaire et le métabolisme, ce qui rend ces cellules un, outil peu coûteux en temps réel continue dépistage toxicité qui peut être facilement adaptée pour l'automatisation à haut débit.
Abstract
Basés sur les cellules de mammifères dans des essais in vitro ont été largement utilisés comme alternatives à l'expérimentation animale pour les études toxicologiques mais ont été limités en raison des coûts financiers et temporels élevés de la préparation d'échantillons en parallèle qui sont rendues nécessaires en raison de la nature destructrice des méthodes de dépistage luciférase à base de luciole . Cette vidéo décrit l'utilisation de cellules de mammifères autonome bioluminescentes, qui ne nécessite pas l'ajout destructrice d'un substrat luciférine, comme une méthode peu coûteuse et facile de surveiller les effets cytotoxiques d'un composé d'intérêt. Cellules de mammifère exprimant de manière stable la bioluminescence bactérienne plein (luxCDABEfrp) de la cassette du gène de produire de manière autonome un signal optique que des pics à 490 nm, sans l'addition d'un substrat de luciférine coûteux et susceptibles d'interférer, l'excitation par une source d'énergie externe, ou la destruction de l'échantillon qui est traditionnellement effectué au cours de la procédure d'imagerie optiques. Cette indépendance de la stimulation extérieure place la charge pour maintenir la réaction de bioluminescence uniquement de la cellule, ce qui signifie que le signal qui en résulte est détectée seulement au cours du métabolisme actif. Cette caractéristique rend la lignée cellulaire lux exprimant un excellent candidat pour une utilisation comme biosentinel contre les effets cytotoxiques parce que les changements dans la production de bioluminescence sont révélateurs d'effets négatifs sur la croissance cellulaire et du métabolisme. De même, le caractère autonome et le manque de destruction de l'échantillon requis permet l'imagerie répétée du même échantillon en temps réel tout au long de la période d'exposition aux substances toxiques et peuvent être effectuées sur plusieurs échantillons en utilisant l'équipement d'imagerie existant de manière automatisée.
Introduction
Aux États-Unis, les produits pharmaceutiques et autres produits destinés à la consommation humaine nécessitent une évaluation approfondie avant qu'ils soient approuvés pour utilisation par les consommateurs par la Food and Drug Administration. Le fardeau financier pour réaliser ce test est placé sur le développeur 1, ce qui augmente considérablement le coût de développement de nouveaux composés et donc se traduit par une augmentation des coûts pour les consommateurs. Alors que traditionnellement une grande partie de ce dépistage a utilisé des sujets animaux pour agir comme mandataires pour des hôtes humains, ce qui s'est avéré être un grand fardeau financier, avec un montant estimé à 2,8 milliards de dollars dépensés chaque année sur ADME / Tox (adsorption, distribution, métabolisme, excrétion et toxicité ) le dépistage seul 2 et preuves croissantes suggérant que les modèles animaux ne peuvent pas prédire de façon fiable les réponses toxicologiques humains 3. Par conséquent, dans les tests de cellules humaines in vitro basée sur la culture a gagné en popularité au cours des deux dernières décennies en raison de sa relativement faiblecoût, un débit plus élevé et une meilleure représentation de la biodisponibilité de l'homme et de la toxicologie 4. Méthodes de dépistage de toxicité culture à base de cellules actuelles emploient divers paramètres, tels que la mesure des niveaux d'ATP, le dépistage de l'activité des enzymes cytoplasmiques endogène disponibles, pour sonder l'intégrité de la membrane cellulaire, ou suivre le niveau de l'activité mitochondriale, pour évaluer la viabilité cellulaire 5 , 6. Cependant, quel que soit le critère choisi, ces méthodes nécessitent tous la destruction de l'échantillon avant que les mesures peuvent être prises, ainsi que la production de données à un seul moment. En conséquence, un grand nombre d'échantillons doivent être préparés et traités en parallèle des études de base de la cinétique toxicologiques, ajoutant encore du coût et de la main-d'œuvre nécessaire pour le développement de nouveaux composés. Alternativement, des tests utilisant sécrétées luciférase comme Gaussia luciférase 7, Vargula luciférase 8 et 9 Metridia luciféraseont été développés qui éliminent la nécessité de lyse cellulaire et nécessitent une fraction des médias pour la mesure du point de terminaison, cependant, ceux-ci sont encore limitées à l'échantillonnage à des moments prédéterminés et nécessite également l'ajout de substrats exogènes lumière d'activation.
Pour éviter, au détriment de la destruction de l'échantillon requise ainsi que d'éliminer le coût de substrats, d'une lignée cellulaire humaine a été conçu, qui exprime la bioluminescence bactérienne plein (lux) de la cassette de gène (luxCDABEfrp) pour permettre un suivi continu de cellules vivantes qui est semblable à l'imagerie des cellules vivantes fluorescente à base de colorant, mais sans que les procédures d'enquête photon d'activation et microscopiques supplémentaires. Cette lignée cellulaire est capable de produire de façon constitutive d'un signal optique pour la détection directe en continu sans avoir besoin de stimulation externe, évitant ainsi la destruction de l'échantillon. Mécaniquement, le signal de bioluminescence produite à partir de ces cellules résultes lorsque l'enzyme luciférase luxAB formé catalyse l'oxydation d'un aldéhyde gras à longue chaîne (synthétisé et régénérée par les produits des gènes luxCDE utilisant des substrats endogènes) en présence d'une réduction de phosphate de riboflavine (FMNH2, qui est recyclé à partir de FMN par le gène FRP produit) et de l'oxygène moléculaire 10. L'expression de la cassette lux dans la cellule-hôte permet donc de la lumière à être produit et détecté sans destruction cellulaire ou une addition de substrat exogène. De même, l'interaction entre les gènes lux et la FMN disponible endogène, et O 2 co-substrats, et l'exigence de maintien d'un environnement qui peut soutenir la conversion des FMN à FMNH2, assure que le signal de bioluminescence qui en résulte ne peut être détectée de vivre , les cellules métaboliquement actives.
Ces exigences ont déjà été exploités pour démontrer que lux-Based sortie bioluminescence est fortement corrélée avec la taille de la population cellulaire 11 et que l'exposition au composé toxique altère production autobioluminescent de façon dose-réponse 12. Ici, nous utilisons un rein embryonnaire humain autobioluminescent précédemment caractérisé (HEK293) de ligne de la cellule 11 de démontrer le dépistage toxicologique automatisé d'un antibiotique de la famille de la bléomycine avec activité endommageant l'ADN connu comme un exemple représentatif pour valider la demande de cellules de mammifères autobioluminescent pour les tests de toxicité.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette méthode illustre l'utilisation de cellules de mammifères autonome bioluminescentes comme un test de dépistage de la cytotoxicité in vitro qui permet aux cellules vivantes à être surveillés en permanence au cours de leur vie. Ce protocole est flexible et peut être modifié pour tenir compte des conditions expérimentales spécifiques selon les besoins. Par exemple, l'expérience présentée ici est approprié pour le suivi des effets toxiques aigus, mais peut être adapté pour év…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces efforts de recherche ont été soutenus par la Division de la National Science Foundation de la chimie, bio-ingénierie, l'environnement, et les transports (CBET) Systèmes sous les numéros d'attribution ÉFAC-0853780 et ÉFAC-1159344 et le National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) sous sentence nombre 1R43ES022567-01, et l'Institut national du cancer, programme d'imagerie du cancer sous récompense numéro CA127745-01. L'instrument Lumina SIIV utilisée dans ce travail a été obtenue à partir de l'Armée de Défense Programme d'Instrumentation de recherche de l'Université américaine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comment |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
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