Интрамиокардиальной сотовый поставки: Наблюдения в мышиных сердцах

Summary

Интрамиокардиальной доставка клеток в мышиных моделях сердечно-сосудистых заболеваний, таких как гипертония или инфаркта миокарда, широко используется для проверки терапевтический потенциал различных типов клеток в регенеративной исследований. Таким образом, подробное описание и четкое визуализация этой хирургической процедуры поможет определить пределы и преимущества сердечно-сосудистых клеток терапевтических анализов в мелких грызунов.

Abstract

Предыдущие исследования показали, что доставка клеток способствует улучшение состояния сердечной функции по высвобождению цитокинов и факторов, которые увеличивают сердечную ткань реваскуляризации и выживаемость клеток. Кроме того, дальнейшие наблюдения показали, что специфические стволовые клетки, такие как сердечная стволовых клеток, мезенхимальных стволовых клеток и cardiospheres иметь возможность интеграции в окружающую миокарда путем дифференцирования в кардиомиоциты, клетки гладких мышц и эндотелиальных клеток.

Здесь мы представляем материалы и методы, чтобы надежно обеспечивают noncontractile клеток в стенки левого желудочка в immunodepleted мышей. Характерные этапы этого микрохирургической процедуры включают анестезии и инъекции обезболивания, эндотрахеальном интубации, разрез, чтобы открыть сундук и подвергать сердце и доставку клеток стерильной 30-иглы и точность микролитра шприца.

Обработка ткани, состоящий из сердца уборки, embeddiнг, секционирование и гистологическое окрашивание показало, что инъекции клеток интрамиокардиальной произведено небольшое повреждение в области эпикарда, а также в стенку желудочка. Noncontractile клетки были сохранены в инфаркт стенки с ослабленным иммунитетом мышей и были окружены слоем фиброзной ткани, вероятно, для защиты от сердечного давления и механической нагрузки.

Introduction

Различные протоколы доставки клеток были протестированы в мышиных и крысиных моделей сердечно-сосудистых заболеваний с целью перевода эффективности, эффективности и безопасности этой экспериментальной процедуры на людях. В небольших грызунов сердца, интрамиокардиальной доставка клетка является наиболее подходящим способом доставки клеток ^1,2, тогда как в сердца крысы антеградном ³ и ⁴ ретроградной инфузии интракоронарного клеток также могут быть использованы. Оба метода имеют ограничения и преимущества. Доставка сотовый через интракоронарного маршруту имеет теоретические преимущества по сравнению с прямой внутримышечной инъекции в продвижении глобального распространения клеток ^3, но он также имеет риска причинения коронарной эмболии ^3,5. Ограничения на интрамиокардиальной поставки связаны с механической травмы, острого воспаления и повреждения ^6,7 инфаркта. В организме человека клетки для сердечной ремонта доставляются интрамиокардиальной инъекции через эндокардиальной или хирургического эпикардиальнойподойти или интракоронарного артериальной маршрут ^8. Инъекции по transvascular маршрутов подходит у пациентов с острым инфарктом и реперфузии миокарда, но не может быть возможно в случае общего закупорки или плохого потока в сосудах, произведенное территории ^9. Прямой впрыск в стенки желудочка по transendocardial или transepicardial инъекции технически возможно в зависимости от состояния здоровья пациента. Действительно, было показано, что этот метод является безопасным ^10,11, хотя для инъекций transepicardial открытой хирургии грудной клетки необходимо и для transendocardial подходы электрофизиологического отображение для каждого пациента необходимо дифференцировать участки жизнеспособного ишемического миокарда или травмированной ^9.

Важно отметить, что в исследованиях клеточной терапии выбор наилучшей соты для пересадки находится в стадии расследования. Краткосрочные анализы (4 недели), показали, что инъекции сердечных стволовых клеток определяется как cardiospheres <sдо> 12 или боковой популяции клеток из костного мозга ¹³ индуцированной сердечной функциональное восстановление у мышей и крыс ^{14 15} моделей инфаркта миокарда путем уменьшения размера рубца и гибели клеток. Аллогенной трансплантации cardiospheres в крысиной инфаркта модели инфаркта без иммуносупрессии был признан безопасным, способствовало регенерации сердца, а также улучшение функции сердца через стимуляцию эндогенных механизмов репарации ^15. Lin-/c-kit + взрослые клетки-предшественники в сердце было показано, что самообновлению, клоногенный и мультипотентны в пробирке и в естественных, и при введении в ишемического сердца крысы восстанавливали большие порции травмированной инфарктом стенки ¹⁶ и имел способность образовывать проводящую и промежуточного размера коронарной артерии ^17. Эти многообещающие данные усилили фазу я и II клинические испытания на людях: инъекции аутологичных и аллогенных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) ^18, cardiospheres ¹⁹, или с-Kit положительные сердца стволовые клетки (CSC) 20 в ишемических человеческих сердец друг показал положительный эффект в сердечной функции в долгосрочных исследованиях. Тем не менее, обширные долгосрочные наблюдения и ретроспективный мета-анализ показал, что лечение стволовыми клетками дает значительное преимущество для некоторых пациентов, но не в других с диапазоном непредсказуемыми последствиями ^21. Вполне возможно, что эти ограничения потребует конструкцию конкретных протоколов доставки клеток для каждого индивида и каждой болезни.

В мышей и крыс моделей, долгосрочные исследования показали, что инъекции клеток не дальнейшего улучшения сердечной функции (12 месяцев). В самом деле, прививки эмбриональных клеток, полученных кардиомиоцитов человеческих стволовых (чЭСК-КМ) были в значительной степени изолированы от принимающей миокарда слоем фиброзной ткани ^22,23. Аналогичные результаты наблюдались после трансплантации интрамиокардиальной скелетных миобластов в сердце инфаркта у мышей ^24. Furthermoповторно, долгосрочная способность аллогенных МСК сохранить функцию в инфарктом сердце было ограничено перехода от immunoprivileged к иммуногенной состоянии после дифференцирования ^25.

Принимая во внимание проблемы и перспективы, изложенные выше, мы показываем здесь, как доставить клетки путем интрамиокардиальной инъекции в мышей. Заметим, что клетки без свойств сократительных кардиомиоцитов не связаны с принимающей миокарда и образуют сплоченную массу тонким фиброзной барьера. Хотя в некоторых случаях этот результат может быть выгодно, следующий анализ может быть полезно понять, как приживление клеток можно модулировать, чтобы генерировать функционально связаны миокарда структуры, а также.

Protocol

Все исследования на животных были проведены в соответствии с нормами международного (Директива 2010/63/EU Европейского парламента) и национальной (внутренних дел Великобритании, Закон 1986 г.) правил. Процедуры, описанные здесь, являются частью нашего плана работы в рамках лицензионных брит?…

Representative Results

Мы вводили HEK293 клетки, которые отличаются от клеток сердца их различной морфологии (рис. 1), с формой булыжной сравнению с удлиненными кардиомиоцитов (рис. 1А). НЕК293 были более реактивный гематоксилин красителя (синий цвет) по сравнению с кардиомиоцитов (розовый цвет), в?…

Discussion

В этой рукописи, мы показали, как выполнить интрамиокардиальной инъекцию клеток в мышиных сердцах. В качестве доказательства этой методологии, мы использовали НЕК293. Важно подчеркнуть, что НЕК293 не используются ни в одном исследовании клеточной терапии и, следовательно, выводы этой рук…

Materials

Isolator	Pfi systems	–	Quotation needed
Heating Pad	Vet Tech Solutions	HE006	For small animals
medetomidine	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
ketamine hydrochloride	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
atipamezole	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
Hair removal cream	Commercial shops	–
buprenorphine	NVS	–	Veterinary prescription is necessary
Leica MZFLIII microscope	Leica	Model S6E	With swing arm stand TS0
Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner	Hamamatsu	RS series
Scanning Electron Microscope	Jeol	JSM-6610
Blunt scissors	FST	14084-09
Minivent	Harvard apparatus	73-0043	Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)
Forceps	FST	11052-10
Retraction system	FST	18200-20	Kit for animals up to 200grams
30G 12mm; ½ inch	BBraun	A210	Fine yellow
microliter syringe	ESSLAB	81201	Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalogue number 83700
6-0 silk suture	Ethicon	W1614T