משלוח הנייד intramyocardial: תוכן בלבבות Murine

Summary

משלוח תא intramyocardial במודלים עכבריים של מחלות לב וכלי דם, כגון יתר לחץ דם או אוטם שריר הלב, הוא בשימוש נרחב כדי לבדוק את הפוטנציאל הטיפולי סוגי תאים שונים במחקרי התחדשות של. לכן, תיאור מפורט ויזואליזציה ברורה של הליך כירורגים זה יעזרו להגדיר את הגבולות ואת היתרונות של ניתוחים טיפוליים תא לב וכלי דם במכרסמים קטנים.

Abstract

מחקרים קודמים הראו כי משלוח התא מקדם שיפור תפקוד לב על ידי שחרורו של ציטוקינים וגורמים המגבירים revascularization רקמת לב והישרדות תא. בנוסף, תצפיות נוספות העלו כי יש תאי גזע ספציפיים, כגון תאי גזע לב, תאי גזע mesenchymal וcardiospheres היכולת לשלב בתוך שריר הלב שמסביב על ידי הבחנה לתוך שריר לב, תאי שריר חלק ותאי האנדותל.

כאן, אנו מציגים את החומרים ושיטות כדי לספק באופן אמין תאי noncontractile לתוך הקיר של החדר השמאלי של עכברי immunodepleted. הצעדים הבולטים של הליך microsurgical זה כרוך בהרדמה והזרקת שיכוך כאבים, אינטובציה intratracheal, חתך כדי לפתוח את החזה ולחשוף את הלב ואספקה ​​של תאים על ידי מחט 30 מד סטרילי ומזרק microliter דיוק.

עיבוד רקמות בהיקף של קצירת לב, embedding, חתך וצביעה היסטולוגית הראתה כי הזרקת תאי intramyocardial הופקה נזק קטן באזור epicardial, כמו גם בקיר של החדר. תאי Noncontractile נשמרו לתוך קיר שריר הלב של עכברי מדוכאי חיסון והיו מוקפים בשכבה של רקמת fibrotic, עשוי להגן מפני לחץ לב ועומס מכאני.

Introduction

פרוטוקולי מסירת תאים שונים נבדקו במודלים עכבריים ועכברושים של מחלות לב וכלי דם, במטרה לתרגם את היעילות, היעילות ובטיחות של הליך הניסוי בחולים אנושיים. בלב מכרסם קטן, משלוח תא intramyocardial הוא השיטה ריאלי ביותר של תא משלוח ^1,2, ואילו בלב החולדה antegrade ³ ועירוי תאים ⁴ intracoronary מדרדר יכול לשמש גם. שני שיטות יש יתרונות ומגבלות. יש תא משלוח דרך מסלול intracoronary יתרונות תיאורטי על זריקה תוך שרירית ישירה בקידום הפצה סלולרי הגלובלית ^3, אבל יש לה גם את הסיכון לגרימת ^3,5 תסחיף כלילית. מגבלות על אספקת intramyocardial משויכות פגיעה מכאנית, דלקת חריפה, ^ו6,7 נזק בשריר הלב. בבני אדם, תאים לתיקון לב מועברים על ידי הזרקת intramyocardial דרך epicardial endocardial או כירורגיםלהתקרב או על ידי תוואי עורקי intracoronary ^8. הזרקה במסלולי transvascular מתאימה בחולים עם אוטם שריר הלב אקוטי וreperfused, אבל ייתכן שלא ניתן במקרה של חסימות בסך הכל או זרימה לקויה בתוך כלי השטח בוצע ^9. הזרקה ישירה לתוך הקיר של החדר על ידי הזרקת transendocardial או transepicardial היא אפשרית מבחינה טכנית, בהתאם למצב בריאות המטופל. ואכן, זה כבר הראה כי טכניקה זו היא בטוחה ^10,11, אם כי להזרקת transepicardial ניתוח חזה פתוח הוא הכרחי ולtransendocardial גישות מיפוי אלקטרו לכל חולה נדרש לבדל את האתרים של שריר הלב איסכמי או מצולק קיימא ^9.

חשוב מכך, במחקרים לטיפול בתא הבחירה של התא הטוב ביותר כדי להיות מושתלים היא עדיין תחת חקירה. ניתוחים לטווח קצר (4 שבועות) הראו כי הזרקה של תאי גזע לב המוגדרים כcardiospheres <sעד> 12 או תאי אוכלוסיית צד ממח עצם ¹³ מושרה התאוששות תפקודית לב ^ב14 ועכברוש ¹⁵ מודלים Murine של אוטם שריר הלב על ידי הפחתת גודל צלקת ומוות של תאים. השתלה אלוגנאית של cardiospheres במודל אוטם שריר הלב חולדה ללא דיכוי חיסוני נמצאה להיות בטוח, קידמה התחדשות לב, ושיפור בתפקוד לב באמצעות גירוי של מנגנוני תיקון אנדוגני ^15. תאי אב Lin-/c-kit + מבוגר בלב הוצגו להיות עצמי חידוש, clonogenic, וmultipotent במבחנה ובחי, וכאשר הוא מוזרק לתוך לב חולדה איסכמי מחדש חלקים גדולה של קיר שריר הלב הפגוע ¹⁶ והיו לי יכולת ליצור עורקים הכליליים מוליך וגודל בינוני ^17. נתונים מבטיחים אלה מונע על שלב I ו-II של ניסויים קליניים בבני אדם: הזרקה של תאי גזע mesenchymal עצמיים ואלוגנאית (MSC) ^18, cardiospheres ¹⁹, או תאי c-Kit חיוביים גזע לב (CSC) 20 בלב אדם איסכמי כל הראו השפעות מועילות בתפקוד לב במחקרים לטווח ארוכים. עם זאת, מעקב ארוך טווח נרחב ומטה אנליזה רטרוספקטיבית, הוכיחו כי טיפול בתאי גזע מספק יתרון משמעותי לחלק מחולים, אבל לא באחרים עם מגוון של תוצאות בלתי צפויות ^21. יתכן כי מגבלות אלה יחייבו את העיצוב של פרוטוקולים ספציפיים של משלוח תא עבור כל אדם ובכל מחלה.

במודלים של עכבר וחולדה, מחקרים ארוך טווח עולים כי הזרקת תאים לא שפרה את תפקוד לב (12 חודשים) נוספת. ואכן, שתלי של cardiomyocytes גזע העוברי האנושי שמקורם בתא (hESC-CM) היו מבודדים במידה רבה משריר לב המארח בשכבה של רקמת fibrotic ^22,23. תוצאות דומות נצפו לאחר השתלת intramyocardial של myoblasts שלד ללב של עכברי infarcted ^24. Furthermoמחדש, ביכולות ארוכות הטווח של MSCs אלוגנאית כדי לשמור על תפקוד בלב infarcted היו מוגבלות על ידי המעבר מimmunoprivileged למדינת immunogenic לאחר התמיינות ^25.

אם ניקח בחשבון את האתגרים וסיכויים שתוארו לעיל, אנו מראים כאן כיצד להעביר את התאים על ידי הזרקת intramyocardial בעכברים. אנו צופים כי תאים ללא מאפייני התכווצות cardiomyocyte אינם קשורים לשריר לב המארח ויוצרים מסה מלוכדת עם מחסום fibrotic דק. אמנם בחלק ממקרי תוצאה זו עשויה להיות יתרון, הניתוח הבא עשוי להיות שימושי כדי להבין כיצד engraftment התא עשוי להיות מווסת כדי ליצור מבני שריר הלב פונקציונלי מחוברים גם כן.

Protocol

כל המחקרים בבעלי החיים בוצעו בהתאם בינלאומי (הוראת 2010/63/EU של הפרלמנט האירופי) ו( Office Home בריטניה, חוק 1986) הלאומי תקנות. ההליכים המתוארים במסמך זה הם חלק מתכנית העבודה תחת רישיון הרשויות בבריטניה שלנו ולא היה מבוצעים במטרה של הקלטה. 1. ?…

Representative Results

אנו מזריקים HEK293 תאים, שניתן להבחין מתאי הלב על ידי המורפולוגיה שונה שלהם (איור 1), עם צורה מרוצפות בהשוואה לשריר הלב המוארך (איור 1 א). תאי HEK293 היו יותר תגובתי לצבע hematoxylin (צבע כחול) בהשוואה לשריר לב (בצבע ורוד), סביר להניח כי התוכן שלהם המוגבר הגרעיני <stron…

Discussion

בכתב היד הזה, שהראינו כיצד לבצע הזרקת intramyocardial של תאים בלב עכברי. כהוכחה של מתודולוגיה זו, יש לנו להשתמש HEK293 תאים. חשוב להדגיש, כי תאי HEK293 אינם משמשים בכל מחקר טיפול בתא, ולכן הממצאים של כתב היד הזה אינם מתאימים לתרגום ישיר לגישה טיפולית. עם זאת, העובדה כי תאי HEK293 אינם תא?…

Materials

Isolator	Pfi systems	–	Quotation needed
Heating Pad	Vet Tech Solutions	HE006	For small animals
medetomidine	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
ketamine hydrochloride	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
atipamezole	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
Hair removal cream	Commercial shops	–
buprenorphine	NVS	–	Veterinary prescription is necessary
Leica MZFLIII microscope	Leica	Model S6E	With swing arm stand TS0
Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner	Hamamatsu	RS series
Scanning Electron Microscope	Jeol	JSM-6610
Blunt scissors	FST	14084-09
Minivent	Harvard apparatus	73-0043	Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)
Forceps	FST	11052-10
Retraction system	FST	18200-20	Kit for animals up to 200grams
30G 12mm; ½ inch	BBraun	A210	Fine yellow
microliter syringe	ESSLAB	81201	Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalogue number 83700
6-0 silk suture	Ethicon	W1614T