Intramyocardique cellulaire livraison: Observations aux coeurs murins

Summary

Fourniture de cellules intra-myocardique dans des modèles murins de maladies cardio-vasculaires telles que l'hypertension ou de l'infarctus du myocarde, est largement utilisé pour évaluer le potentiel thérapeutique de différents types de cellules dans les études de régénération. Par conséquent, une description détaillée et une visualisation claire de cette intervention chirurgicale aideront à définir les limites et les avantages des analyses thérapeutiques de cellules cardiovasculaires chez les petits rongeurs.

Abstract

Des études antérieures ont montré que la capacité des cellules favorise l'amélioration de la fonction cardiaque par la libération de cytokines et de facteurs qui augmentent la revascularisation du tissu cardiaque et la survie cellulaire. En outre, des observations ont révélé que les cellules souches spécifiques, tels que les cellules souches cardiaques, les cellules souches mésenchymateuses et cardiospheres ont la capacité d'intégrer au sein du myocarde environnant en se différencier en cardiomyocytes, les cellules musculaires lisses et les cellules endotheliales.

Ici, nous présentons les matériaux et les méthodes susceptibles de fournir de manière fiable les cellules non contractiles dans la paroi ventriculaire gauche de la souris immunodéplétion. Les étapes marquantes de cette procédure microchirurgicale impliquent l'anesthésie et l'injection de l'analgésie, intratrachéale intubation, incision pour ouvrir le coffre et exposer le coeur et la livraison des cellules par une aiguille stérile de calibre 30 et une seringue de précision microlitre.

Le traitement des tissus comprenant de coeur récolte, embedding, de sectionnement et coloration histologique a montré que l'injection intra-myocardique de cellules produit une petite dommages dans la zone épicardique, ainsi que dans la paroi ventriculaire. Les cellules non contractiles ont été retenues dans la paroi du myocarde de souris immunodéprimées et sont entourés par une couche de tissu fibreux, de nature à l'abri de la pression cardiaque et de la charge mécanique.

Introduction

Divers protocoles de transport cellulaire ont été testés dans des modèles murins de rat et de maladies cardio-vasculaires, dans le but de traduire l'efficacité, l'efficacité et l'innocuité de cette procédure expérimentale chez des patients humains. Dans les petits coeurs de rongeurs, la livraison de cellules intramyocardique est la méthode la plus réaliste de la prestation de cellule ^1,2, alors que dans le antérograde de coeur de rat ³ et rétrograde injection de cellules de ⁴ intracoronaire peut également être utilisé. Les deux méthodes ont des limites et avantages. livraison cellulaire par voie intracoronaire présente des avantages théoriques sur l'injection intramusculaire directe dans la promotion de la diffusion de la cellule mondiale ^3, mais il a aussi le risque de provoquer une embolie coronarienne ^3,5. Limitations de livraison intramyocardique sont associées à une lésion mécanique, une inflammation aiguë et des lésions myocardiques ^6,7. Chez les humains, les cellules pour la réparation cardiaque sont administrés par injection intra-myocardique par un épicardique endocavitaire ou chirurgicalapprocher ou par intracoronaire artère ^8. Injection par voie transvasculaire est adapté chez les patients présentant un infarctus aigu du myocarde et reperfusé, mais peut-être pas possible dans le cas d'occlusions totales ou mauvaise circulation dans les vaisseaux du territoire effectuée ^9. L'injection directe dans la paroi ventriculaire par injection transendocardique ou transépicardique est techniquement réalisable en fonction de l'état de santé du patient. En effet, il a été montré que cette technique est sûre ^10,11, bien que pour l'injection transépicardique une chirurgie à thorax ouvert est nécessaire pour transendocardique et se rapproche d'une cartographie électrophysiologique pour chaque patient est nécessaire pour différencier les sites de myocarde ischémique ou portant des cicatrices viable ^9.

Fait important, dans les études de thérapie cellulaire du choix de la meilleure cellule pour être transplanté est encore à l'étude. Analyses à court terme (4 semaines) ont montré que l'injection de cellules souches cardiaques définies comme cardiospheres <sjusqu'à> 12 cellules ou de la population des côtés de la moelle osseuse induite par ¹³ la récupération fonctionnelle cardiaque chez le rat et la souris ^{14 15} modèles de l'infarctus du myocarde en réduisant la taille de la cicatrice et la mort cellulaire. L'allogreffe de cardiospheres dans un modèle de l'infarctus du myocarde de rat sans immunosuppression a été trouvé pour être sûr, promu la régénération cardiaque et améliore la fonction cardiaque par stimulation des mécanismes de réparation endogènes ^15. Lin-/c-kit + adultes de cellules souches dans le coeur ont été montrés pour être auto-renouvellement, clonogenic, et multipotentes in vitro et in vivo, et lorsqu'il est injecté dans un coeur de rat ischémique reconstitué une grande partie de la paroi du myocarde blessé ¹⁶ et eu l' capacité à former des artères coronaires ¹⁷ conductrice et de taille intermédiaire. Ces données prometteuses ont alimenté la phase I et II des essais cliniques chez l'homme: l'injection de cellules souches mésenchymateuses autologues et allogéniques (MSC) ^{18, 19} cardiospheres, ou de cellules souches cardiaques positifs c-Kit (SCC) 20 dans les cœurs ischémiques chaque montré des effets bénéfiques de la fonction cardiaque dans les études à long terme. Néanmoins, vaste à long terme de suivi et de méta-analyse rétrospective ont montré que la thérapie de cellules souches apporte un bénéfice important à certains patients, mais pas dans d'autres avec une série de résultats imprévisibles ^21. Il est possible que ces limitations nécessiteront la conception de protocoles spécifiques de délivrance de cellule pour chaque individu et de chaque maladie.

Dans des modèles de souris et de rat, des études à long terme ont montré que l'injection de cellules n'a pas d'améliorer encore la fonction cardiaque (12 mois). En effet, les greffes de cardiomyocytes souches embryonnaires humaines dérivées de cellules (CSEh-CM) ont été largement isolés du myocarde hôte par une couche de tissu fibreux ^22,23. Des résultats similaires ont été observés après transplantation de myoblastes squelettiques intramyocardique dans le cœur de souris ayant subi un infarctus ^24. Furthermore, la capacité à long terme de cellules souches mésenchymateuses allogènes pour préserver la fonction cardiaque en l'infarctus a été limité par la transition d'un état ​​à un immunoprivilégiés immunogène après différenciation ^25.

Prenant en considération les défis et les perspectives énoncées ci-dessus, nous montrons ici comment offrir cellules par injection intra-myocardique chez la souris. Nous observons que les cellules sans propriétés contractiles des cardiomyocytes ne sont pas connectés avec le myocarde hôte et forment une masse homogène avec une barrière fibreuse mince. Bien que dans certains cas, ce résultat peut être avantageux, l'analyse qui suit peut être utile de comprendre comment la prise de greffe de cellules peut être modulée pour générer des structures du myocarde fonctionnellement connectés ainsi.

Protocol

Toutes les études sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les organisations internationales (la directive 2010/63/UE du Parlement européen) et national (Home Office britannique, loi de 1986) des règlements. Les procédures décrites ici font partie de notre plan de travail en vertu des autorisations de licence au Royaume-Uni et n'ont pas été entrepris dans le but de l'enregistrement. Une. Préparation des cellules Ce protocole décrit…

Representative Results

Nous avons injecté des cellules HEK293, qui sont distinguables des cellules cardiaques par leur morphologie différente (figure 1), avec une forme de pavé par rapport aux cardiomyocytes allongés (Figure 1A). Cellules HEK293 ont été plus réactif à l'hématoxyline colorant (de couleur bleue) par rapport à des cardiomyocytes (de couleur rose), probablement en raison de leur contenu nucléaire augmenté (figure 1A). Pour distinguer en outre les cellules injecté…

Discussion

Dans ce manuscrit, nous avons montré comment effectuer l'injection intra-myocardique de cellules dans les coeurs de souris. Comme preuve de cette méthode, nous avons utilisé des cellules HEK293. Il est important de souligner que les cellules HEK293 sont pas utilisés dans une étude de thérapie cellulaire et donc les conclusions de ce manuscrit ne sont pas appropriés pour la traduction directe d'une approche thérapeutique. Cependant, le fait que les cellules HEK293 sont des cellules contractiles pas et ne …

Materials

Isolator	Pfi systems	–	Quotation needed
Heating Pad	Vet Tech Solutions	HE006	For small animals
medetomidine	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
ketamine hydrochloride	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
atipamezole	National veterinary Service	–	Veterinary prescription is necessary
Hair removal cream	Commercial shops	–
buprenorphine	NVS	–	Veterinary prescription is necessary
Leica MZFLIII microscope	Leica	Model S6E	With swing arm stand TS0
Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner	Hamamatsu	RS series
Scanning Electron Microscope	Jeol	JSM-6610
Blunt scissors	FST	14084-09
Minivent	Harvard apparatus	73-0043	Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)
Forceps	FST	11052-10
Retraction system	FST	18200-20	Kit for animals up to 200grams
30G 12mm; ½ inch	BBraun	A210	Fine yellow
microliter syringe	ESSLAB	81201	Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalogue number 83700
6-0 silk suture	Ethicon	W1614T