दो प्रकार के पाँवों का कड़ी चमड़ी का पशु Crustacean के आठ सेल भ्रूण से एक एकल कोशिका के एबलेशन<em> Parhyale hawaiensis</em
Summary
दो प्रकार के पाँवों का कड़ी चमड़ी का पशु Parhyale hawaiensis जलीय भ्रूण विज्ञान और तुलनात्मक Arthropod विकास और विकास के अध्ययन के लिए एक आशाजनक मॉडल जीव है. इस प्रोटोकॉल Parhyale की जल्दी दरार मंच भ्रूण से एकल blastomeres के हाथ से हटाने के लिए एक विधि का वर्णन करता है.
Abstract
दो प्रकार के पाँवों का कड़ी चमड़ी का पशु Parhyale hawaiensis दुनिया भर अंतर्ज्वारिय समुद्री निवास में मिला एक छोटा सा जलीय है. पिछले दशक के दौरान, Parhyale अच्छी तरह से अध्ययन Arthropod मॉडल जीव ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के लिए एक उपयोगी outgroup तुलना प्रदान करने, विकास की प्रयोगशाला के अध्ययन के लिए एक आशाजनक मॉडल जीव के रूप में उभरा है. ड्रोसोफिला की syncytial चोली के विपरीत, Parhyale के शुरुआती चोली holoblastic हैं. जल्दी blastomeres में इंजेक्शन ट्रेसर रंगों का उपयोग भाग्य मानचित्रण तीनों जनन परतों और रोगाणु लाइन आठ सेल मंच द्वारा स्थापित कर रहे हैं कि पता चला है. इस स्तर पर, तीन blastomeres बाहरी झिल्ली को जन्म दे नसीब कर रहे हैं, तीन mesoderm को जन्म दे नसीब, और शेष दो blastomeres क्रमशः अन्तर्जनस्तर और रोगाणु लाइन के व्यापारियों रहे हैं. हालांकि, प्रसूखण्ड पृथक प्रयोगों Parhyale भ्रूण भी महत्वपूर्ण नियामक capabiliti के अधिकारी पता चला है किआठ सेल मंच पर ablated blastomeres के भाग्य शेष blastomeres में से कुछ के वंशज द्वारा लिया जा सकता है तों, ऐसा है कि. इंजेक्शन और phototoxic रंगों या मैनुअल पृथक के बाद सक्रियण: प्रसूखण्ड पृथक पहले दो तरीकों में से एक ने वर्णित किया गया है. हालांकि, photoablation blastomeres मारता है, लेकिन भ्रूण से मृत सेल शरीर को दूर नहीं करता. विशिष्ट blastomeres की पूरी शारीरिक हटाने इसलिए कुछ अनुप्रयोगों के लिए पृथक से एक पसंदीदा तरीका हो सकता है. यहाँ हम जीवित है और बरकरार शेष blastomeres रखते हुए सेल शरीर की पूरी तरह हटाने के लिए आवश्यक उपकरणों और मैन्युअल प्रक्रिया illustrating, Parhyale भ्रूण की आठ सेल चरण से ही blastomeres के हाथ से हटाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. इस प्रोटोकॉल आठ सेल स्तर पर, या अन्य जल्दी दरार चरणों की blastomeres के लिए किसी भी Parhyale सेल करने के लिए लागू किया जा सकता है. इसके अलावा, सिद्धांत रूप में इस प्रोटोकॉल जल्दी clea के लिए लागू किया जा सकता हैअन्य holoblastically cleaving समुद्री अकशेरूकीय के vage चरण भ्रूण.
Introduction
दो प्रकार के पाँवों का कड़ी चमड़ी का पशु जलीय Parhyale hawaiensis विकासवादी विकास जीव विज्ञान अनुसंधान 1 में उपयोग के लिए महान क्षमता के साथ एक होनहार मॉडल जीव के रूप में पिछले एक दशक में उभरा है. फल. डी. ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर मक्खी है arthropods के अलावा, सबसे मॉडल प्रणाली कीड़े हैं, और सबसे बड़े पैमाने पर इन का अध्ययन मेलानोगास्टर कीट क्रम Diptera का एक सदस्य है, और basally शाखाओं में कीड़े 2 के उन लोगों के लिए सम्मान के साथ प्राप्त कर रहे हैं कि इस तरह प्रदर्शित करता है कई embryological सुविधाओं के रूप में. इसके अलावा, कीड़े कीड़े pancrustaceans बुलाया लंबे समय से "प्राकृतिक" समूह के भीतर उनके करीबी रिश्तेदार हैं जिसका अर्थ है कि subphylum Pancrustacea 3 नेस्ट, और इस समूह paraphyletic है कि कर रहे हैं. इस अलावा basally कीट मॉडल शाखाओं में बंटी को पता चलता है कि अन्य क्रसटेशियन की पढ़ाई विकासात्मक लक्षण के विकास के इतिहास का एक व्यापक दृष्टि प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं एकइतनी अच्छी तरह से डी में अध्ययन किया गया है कि एन डी आणविक तंत्र मेलानोगास्टर. हालांकि, बहुत कुछ क्रसटेशियन अच्छी तरह से विकास की प्रयोगात्मक प्रयोगशाला विश्लेषण के लिए स्थापित किया गया है. दो प्रकार के पाँवों का कड़ी चमड़ी का पशु पी. hawaiensis प्रयोगात्मक तकनीकों की एक श्रृंखला के लिए उत्तरदायी एक अत्यंत विनयशील प्रयोगशाला मॉडल प्रणाली, है. Amphipods उनके माता – पिता superorder Peracarida (समुद्र तट हॉपर, scuds, और अच्छी तरह से चिंराट) के भीतर कई अनूठी विशेषताओं को प्रदर्शित, और इसलिए अपेक्षाकृत क्रसटेशियन के इस समूह के भीतर प्राप्त करने के लिए लगा रहे हैं. फिर भी, Parhyale द्वारा की पेशकश embryological और कार्यात्मक आनुवंशिक हेरफेर के सापेक्ष कम यह दो प्रकार के पाँवों का कड़ी चमड़ी का पशु मॉडल जीवों की वर्तमान सूची के लिए एक मूल्यवान इसके अतिरिक्त है.
एक प्रयोगशाला पशु, पी. के रूप में hawaiensis कई लाभ प्रदान करता है. पशु तापमान और salinities की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए सहिष्णु हैं, और कृत्रिम समुद्री जल 1 की बड़ी संस्कृतियों में अच्छी तरह से जीवित रहते हैं. यह betw भेद करना आसान हैस्पष्ट रूपात्मक मतभेद, संभोग के दौरान महिलाओं को काबू करने के लिए उपयोग पुरुषों है कि सबसे विशेष रूप से, बड़े, झुका, पूर्वकाल ट्रंक उपांग पर आधारित een पुरुषों और महिलाओं. Embryological और विकास कार्य के लिए, पी. hawaiensis कई बहुत आकर्षक विशेषताएं है. Embryogenesis लगभग 10 दिनों तक रहता है और यौन परिपक्वता के समय 28 डिग्री सेल्सियस पर लगभग छह सप्ताह है (लेकिन Parhyale लगभग 20-30 डिग्री सेल्सियस से लेकर तापमान में अच्छी तरह से बचता ध्यान दें कि, और कहा कि विस्तृत विकासात्मक मचान जानकारी 18 डिग्री सेल्सियस 4 पर उठाया भ्रूण के लिए उपलब्ध है , 25 डिग्री सेल्सियस 4, और 26 डिग्री सेल्सियस 5,6). वयस्क प्रयोगशाला में सभी वर्ष दौर दोस्त, ताकि भ्रूण वर्ष के किसी भी समय पर उपलब्ध हैं. मादा पहले कई पैरों के जोड़े (आंकड़े 1 ए और 1 बी) के बीच स्थित एक उदर बच्चे थैली में निषेचित अंडे (महिला की उम्र पर निर्भर करता है) 2-20 रखना, और यह इन भ्रूण को इकट्ठा करने के लिए संभव हैमहिला की हत्या या भ्रूण (चित्रा 1C) को नुकसान पहुँचाए बिना बहुत जल्दी विकास में है. भ्रूण, अंडे सेने के लिए फ़िल्टर के माध्यम से कृत्रिम समुद्र के पानी में जीवित रहने के बाद जीन अभिव्यक्ति या ऊतकीय विश्लेषण 7 के लिए तय किया जा सकता है, और एक विस्तृत मचान तालिका विकास से 5 तक प्रगति की सटीक पहचान की अनुमति देता है. मजबूत प्रोटोकॉल सीटू संकरण 8-15 या 4,16,17 immunostaining में से जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, शाही सेना के हस्तक्षेप 13,15 या morpholinos 12, और स्थिर रोगाणु लाइन से कार्यात्मक पछाड़ना 18 transgenesis. Transgenesis प्रणाली, inducible अभिव्यक्ति 14 और 19 तरीकों में भी पी. में जीन समारोह की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है बढ़ाने जाल का प्रयोग hawaiensis. एक सार्वजनिक रूप से उपलब्ध जीनोम अनुक्रम वर्तमान में उपलब्ध नहीं है, oogenesis और embryogenesis दौरान उत्पादित टेप युक्त एक transcriptome मधुमक्खी हैएन डी नोवो इकट्ठा किया और 20 एनोटेट, और जीन की खोज की सुविधा, एक खोज डेटाबेस 21 में जमा है. संक्षेप में, पी. hawaiensis विकास को समझने के लिए कई प्रयोगात्मक और आनुवंशिक दृष्टिकोण के लिए उपयुक्त एक अत्यंत विनयशील मॉडल जीव है.
डी. के शुरुआती syncytial चोली के विपरीत मेलानोगास्टर, पी. hawaiensis भ्रूण holoblastically निषेचन (2A चित्रा) निम्नलिखित फोड़ना. वंश अनुरेखण विश्लेषण तीसरे दरार से, तीसरे दरार blastomeres के प्रत्येक विशेष रूप से तीन रोगाणु परतों में से एक या रोगाणु लाइन 6 (चित्रा 2 बी) को जन्म दे नसीब है कि दिखाया गया है. इन आंकड़ों को एक साथ माइक्रोएरे डेटा 22 के साथ, सेल वंश 6,23 विश्लेषण करती है, और प्रसूखण्ड अलगाव प्रयोगों 4 विकासात्मक क्षमता सीईएल के असममित विरासत से कम से कम किसी तीसरे दरार blastomeres को अलग कर रहे हैं सुझाव दिया है किएल भाग्य निर्धारकों. कोशिकाओं के अभाव के संकेत के रूप तदनुसार, (Parhyale सेल वंश नामकरण 6 में "जी" कहा जाता है) रोगाणु लाइन अग्रदूत आठ सेल स्तर पर हटा दिया गया था, जिसमें प्रसूखण्ड पृथक प्रयोगों में, भ्रूण, बाद में विकास के चरणों 4 पर रोगाणु कोशिकाओं की कमी सबसे मेटाजोअन 24 में एक रोगाणु लाइन मार्कर है जो प्रोटीन वासा, व्यक्त. इसके विपरीत, दैहिक प्रसूखण्ड पृथक प्रयोगों से पता चला है कि पी. hawaiensis भ्रूण भी महत्वपूर्ण नियामक क्षमताओं के अधिकारी आठ सेल मंच पर ablated mesoderm या बाह्य त्वक स्तर अग्रदूत blastomeres के भाग्य शेष blastomeres 25 में से कुछ के वंशज द्वारा लिया जा सकता है कि इस तरह के. कैसे नियामक सेल भाग्य प्रतिस्थापन हो सकता है, और दैहिक blastomeres द्वारा स्वायत्त सेल भाग्य गोद लेने की हद तक अनजान बनी हुई है. ऐसे प्रसूखण्ड पृथक रूप प्रायोगिक embryological तकनीक understan में उपयोगी हो सकता हैडिंग सापेक्ष स्वायत्तता और सेल भाग्य का निर्णय 26,27 के nonautonomy और पी. के अध्ययन में रुचि के इसलिए कर रहे हैं hawaiensis embryogenesis.
बहिर्जनस्तरीय और mesodermal प्रजातियों की नियामक प्रतिस्थापन दिखा दिया कि प्रयोगों में, प्रसूखण्ड पृथक इंजेक्शन 28 और phototoxic रंजक 25 के बाद उत्तेजना द्वारा किया गया था. इस तकनीक इंजेक्शन प्रसूखण्ड (ओं) की हत्या पर प्रभावी है, यह पूरी तरह से भ्रूण से मृत सेल शरीर को दूर नहीं करता. इसके अलावा, मतभेद सेल वंश फ्लोरोसेंट वंश tracers 28,29 साथ blastomeres इंजेक्शन द्वारा embryogenesis के gastrulation चरणों के माध्यम से एकत्र आंकड़ों, और एक ही भ्रूण चरणों 23 के विकास के माध्यम से बेफिक्र blastomeres निम्न द्वारा एकत्र आंकड़ों के बीच मनाया गया है. विशिष्ट blastomeres की पूरी शारीरिक हटाने इसलिए कुछ अनुप्रयोगों के लिए पृथक से एक पसंदीदा तरीका हो सकता है.
हम पहले से सेल वंश के परिणाम प्रकाशित एकल कक्षों मैन्युअल रूप से 23 ablated गया जिसमें भ्रूण का विश्लेषण करती है. हालांकि, जल्दी दरार मंच भ्रूण से एकल blastomeres को दूर करने के लिए आवश्यक नाज़ुक कार्रवाई अभी तक पूरी तरह से वर्णित नहीं किया गया है. यहाँ हम पी. के संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत hawaiensis भ्रूण और एक आठ सेल चरण भ्रूण से एक भी प्राथमिक कोशिका का मार्गदर्शन पृथक. इस पद्धति का लक्ष्य सेलुलर व्यवहार और embryogenesis और बाद भ्रूण विकास के दौरान शेष कोशिकाओं के सेल भाग्य दक्षताओं के अवलोकन की अनुमति, भ्रूण से सेल शरीर की पूरी हटाने को प्राप्त है. हमारे प्रोटोकॉल रोगाणु लाइन अग्रदूत जी (चित्रा -2) को हटाने से पता चलता है, लेकिन या पहले दरार चरणों की blastomeres के लिए, आठ सेल मंच पर किसी भी कक्ष के लिए लागू किया जा सकता है. सिद्धांत रूप में, इस प्रोटोकॉल othe के जल्दी दरार मंच भ्रूण से एकल कक्षों को दूर करने के लिए लागू किया जा सकता हैआर holoblastically समुद्री अकशेरूकीय cleaving.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम पुस्तिका पृथक और दो प्रकार के पाँवों का कड़ी चमड़ी का पशु पी. के प्रारंभिक दरार चरणों से एकल blastomeres की पूरी शारीरिक हटाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन hawaiensis. हम एक आठ सेल चरण भ्रूण से एक रोगाणु ला?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कैमरे के काम के लिए तृप्ति गुप्ता और Frederike Alwes सेल पृथक तकनीक को परिष्कृत करने में सहायता के लिए, और डाटा, वीडियो और पांडुलिपि पर प्रतिक्रिया के लिए Extavour प्रयोगशाला के सदस्यों Rayhan आरिफ और Hassaan Shahawy धन्यवाद. इस काम आंशिक हार्वर्ड स्टेम सेल इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित किया गया (बीज अनुदान संख्या एसजी-0057-10-00) एलिसन मेडिकल फाउंडेशन (नई विद्वान पुरस्कार संख्या एजी-NS-07010-10) CGE के लिए, और हार्वर्ड कॉलेज रिसर्च प्रोग्राम पुरस्कार के लिए ARN.
Materials
| 15 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-630 | For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. VWR |
| 22 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-632 | For making mouth pipette tips. VWR |
| 3 cm petri dishes | Thermo Scientific | 25382-334 | Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. VWR |
| 48-well plates | Greiner Bio-One | 82051-004 | For culturing embryos following ablation. VWR |
| Bottle top filters 0.2 micron | Nalge Nunc International | 28199-296 | For creating FASW (See below) VWR |
| Bunsen burner | VWR | 89038-530 | For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. VWR |
| Diamond scribe | Musco Sports Lighting | 52865-005 | For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. VWR |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps – the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. Fine Science Tools |
| Fungizone-Amphotericin B | Sigma | A2942 | Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. Sigma Aldrich |
| Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm) | World Precision Instruments | 1B100-4 | need to include glass capillary and needle puller machine? World Precision Instruments |
| Glass watchglass 300 mm diameter | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. Electron Microscopy Sciences |
| Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW) | Instant Ocean | IS160 | Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. Aquatic EcoSystems |
| Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW) | Instant Ocean | IS160 | Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. Aquatic EcoSystems |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 21905-026 | For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. VWR |
| Mouth pipette adaptor | Drummond Labware | A5177-5EA | Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. Sigma Aldrich |
| Mouth pipette tubing | Aldrich | Z280356 | Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. Sigma Aldrich |
| Needle Puller | Sutter Instrument Company | P97 | For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. Sutter Instrument Company |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Mediatech | 45000-650 | Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. VWR |
| Rubber bulb | Electron Microscopy Sciences | 100488-418 | For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. VWR |
| Sylgard 184 | K. R. Anderson, Inc. | NC9659604 | Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. Fisher Scientific |
| Tungsten wire 0.004 inches diameter | A-M Systems | 719000 | Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. A-M Systems |
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