Ablation d'une cellule unique de huit cellules d'embryons de crustacés amphipodes les<em> Parhyale hawaiensis</em

Summary

Le hawaiensis amphipode Parhyale est un organisme modèle prometteur pour l'étude de l'embryologie crustacé et le développement des arthropodes et l'évolution comparatives. Ce protocole décrit une méthode de suppression manuelle de blastomères simples à partir d'embryons à un stade préliminaire de clivage de Parhyale.

Abstract

Le hawaiensis amphipode Parhyale est un petit crustacé trouvé dans les habitats marins intertidaux à travers le monde. Au cours de la dernière décennie, Parhyale a émergé comme un organisme modèle prometteur pour les études de laboratoire de développement, fournissant une comparaison de outgroup utile pour le modèle d'arthropodes bien étudié organisme Drosophila melanogaster. Contrairement aux clivages syncytial de drosophile, les premiers clivages sont des Parhyale holoblastique. cartographie destin utilisant des colorants traceurs injectés dans blastomères précoces ont montré que les trois feuillets embryonnaires et la lignée germinale sont établis par le stade de huit cellules. A ce stade, trois blastomères sont condamnées à donner naissance à l'ectoderme, trois sont condamnés à donner lieu à l'mésoderme, et les deux blastomères restants sont les précurseurs de la ligne de l'endoderme et le germe respectivement. Cependant, les expériences d'ablation blastomères ont montré que les embryons Parhyale possèdent également capabiliti réglementaire importantees, de sorte que les sorts de blastomères ablation au stade de huit cellules peuvent être prises en charge par les descendants de certains des blastomères restants. Blastomere ablation a été précédemment décrit par l'une des deux méthodes: l'injection et l'activation subséquente de colorants phototoxiques ou ablation manuel. Cependant, photoablation tue blastomères mais ne supprime pas le corps de cellules mortes de l'embryon. Élimination physique complète des blastomères spécifiques peut donc être un procédé préféré d'ablation pour certaines applications. Nous présentons ici un protocole pour l'enlèvement manuel de blastomères simples de la scène à huit cellules d'embryons Parhyale, illustrant les instruments et les procédures manuelles nécessaires à la suppression complète du corps de la cellule tout en gardant les blastomères restants vivant et intact. Ce protocole peut être appliqué à n'importe quelle cellule Parhyale au stade huit cellules, ou à d'autres stades de blastomères de clivage précoce. De plus, en principe, ce protocole pourrait être applicable à CLEA tôtembryons au stade Våge d'autres invertébrés marins clivage holoblastically.

Introduction

Le Parhyale hawaiensis amphipode crustacé a émergé au cours de la dernière décennie comme un organisme modèle prometteur avec un grand potentiel pour une utilisation dans la recherche en biologie évolutive du développement ^1. Parmi les arthropodes, la plupart des systèmes modèles sont des insectes, et la plus étudiée de ces derniers est la mouche Drosophila melanogaster. D. melanogaster est un membre de l'ordre des insectes diptères, et que ces affiche de nombreuses caractéristiques embryologiques qui sont dérivées par rapport à ceux des insectes ramification basale ^2. En outre, les insectes sont imbriqués dans le sous-embranchement Pancrustacea ^3, ce qui signifie que les insectes ont leurs plus proches parents dans le groupe de longue date "naturel" appelé pancrustaceans, et que ce groupe est paraphylétique. Cela suggère que, en plus de ramification basale modèles d'insectes, les études d'autres crustacés sont nécessaires pour avoir une vue plus large de l'histoire de l'évolution des traits développement d'unmécanismes moléculaires nd qui ont été si bien étudiés dans D. melanogaster. Cependant, très peu de crustacés ont été bien établies pour l'analyse de laboratoire expérimental de développement. L'amphipode P. hawaiensis est un système de modèle de laboratoire très docile, prête à une gamme de techniques expérimentales. Amphipodes affichent de nombreuses fonctionnalités uniques dans leur superorder mère Peracarida (trémies de plage, gammares, et crevettes ainsi), et sont donc censés être relativement dérivé dans ce groupe de crustacés. Néanmoins, la relative facilité de manipulation génétique embryonnaire et fonctionnel offert par Parhyale faire cet amphipode un ajout précieux à l'inventaire actuel des organismes modèles.

Comme un animal de laboratoire, P. hawaiensis offre de nombreux avantages. Les animaux sont tolérantes à un large éventail de températures et de salinité, et survivent bien dans les grandes cultures de l'eau de mer artificielle ^1. Il est facile de distinguer entrhommes et les femmes een basées sur les différences morphologiques évidentes, plus particulièrement, les grands crochets, les appendices du tronc antérieures que les hommes utilisent pour saisir les femelles pendant l'accouplement. Pour les travaux embryologique et développement, P. hawaiensis a plusieurs caractéristiques très attrayantes. Embryogenèse dure environ dix jours et le temps de la maturité sexuelle est d'environ six semaines à 28 ° C (mais notez que Parhyale survit bien à des températures allant d'environ 20-30 ° C, et que la stadification de développement détaillé est disponible pour les embryons soulevées à 18 º C ⁴ , 25 ° C ^4, et 26 ° C ^5,6). Les adultes s'accouplent toute l'année dans le laboratoire, si des embryons sont disponibles à tout moment de l'année. Les femelles pondent 2-20 (en fonction de l'âge des femmes) œufs fécondés dans une poche incubatrice ventrale située entre les premières paires de pattes (figures 1A et 1B), et il est possible de rassembler ces embryonss très tôt dans le développement sans tuer la femelle ou d'endommager les embryons (figure 1C). Les embryons survivent dans l'eau filtrée de mer artificielle jusqu'à l'éclosion, peuvent être fixés pour l'expression du gène ultérieur ou l'analyse histologique ^7, et une table de transfert détaillée permet une identification précise des progrès grâce au développement ^5. Protocoles robustes ont été utilisés pour effectuer l'analyse de l'expression des gènes par hybridation in situ ^8-15 ou immunomarquage ^4,16,17 dans, knockdown fonctionnelle par interférence ARN ^13,15 ou morpholinos ^12, et la lignée germinale stable transgénèse ^18. Utilisation du système de transgenèse, une expression inductible ¹⁴ et l'amplificateur piège ¹⁹ méthodes peuvent également être utilisées pour étudier la fonction de gènes dans P. hawaiensis. Bien que la séquence du génome accessible au public n'est actuellement pas disponible, un transcriptome contenant des transcriptions produites au cours de l'ovogenèse et de l'embryogenèse a abeillen de novo assemblées et annotées ^20, et déposés dans une base de données consultable ^21, ce qui facilite la découverte de gènes. En somme, P. hawaiensis est un organisme modèle très maniable adapté à de multiples approches expérimentales et génétiques à la compréhension du développement.

Contrairement aux clivages syncytial début de D. melanogaster, P. embryons de hawaiensis clivent holoblastically après la fécondation (figure 2A). analyse traçage de Lineage a montré que par la troisième clivage, chacune des tiers blastomères de clivage est particulièrement malheureuse pour donner naissance à l'un des trois feuillets embryonnaires ou la lignée germinale ⁶ (figure 2B). Ces données, ainsi que les données de puces à ADN ^22, analyses lignée cellulaire ^6,23, et les expériences d'isolement de blastomère ⁴ ont suggéré que les potentiels de développement sont séparés à au moins certains tiers clivage blastomères par héritage asymétrique de cell déterminants du devenir. En conséquence, dans des expériences blastomère d'ablation, dans lequel le précurseur de la lignée germinale (appelée "g" dans le Parhyale lignée cellulaire nomenclature ⁶⁾ a été éliminé à l'étape de cellule huit, les embryons n'avaient pas les cellules germinales à des stades de développement ultérieurs ^4, comme indiqué par l'absence de cellules exprimer la protéine Vasa, qui est un marqueur de la lignée germinale dans la plupart des métazoaires ^24. En revanche, les expériences somatiques d'ablation blastomères ont montré que P. embryons de hawaiensis possèdent également des capacités réglementaires importantes, telles que les sorts de mésoderme ou ectoderme blastomères précurseurs ablation au stade de huit cellules peuvent être prises en charge par les descendants de certains des blastomères restants ^25. Comment réglementaire remplacement du destin cellulaire peut se produire, et la mesure de l'adoption autonome du destin cellulaire par blastomères somatiques, reste inconnu. Techniques embryologiques expérimentales telles que blastomère ablation peuvent être utiles dans compréding l'autonomie relative et nonautonomy des décisions du destin cellulaire ^26,27 et sont donc d'un intérêt dans l'étude de P. hawaiensis embryogenèse.

Dans les expériences qui ont démontré le remplacement de régulation de l'ectoderme et mésoderme lignées, ablation blastomère a été réalisée par injection ²⁸ et excitation ultérieure de colorants phototoxiques ^25. Bien que cette technique est efficace pour tuer le blastomère (s) injecté, il ne supprime pas complètement le corps de cellules mortes de l'embryon. En outre, des différences ont été observées entre les données de la lignée de cellules recueillies jusqu'aux stades de l'embryogenèse de gastrulation par injection blastomères avec des traceurs de la lignée fluorescentes ^28,29, et les données recueillies par la suite blastomères perturbés par le développement des mêmes stades embryonnaires ^23. Élimination physique complète des blastomères spécifiques peut donc être un procédé préféré d'ablation pour certaines applications.

Nous avons déjà publié les résultats de la lignée cellulaire analyse des embryons dont les cellules simples ont été soumises à une ablation manuellement ^23. Toutefois, les opérations délicates nécessaires pour éliminer blastomères simples à partir d'embryons de stade de clivage début n'ont pas encore été entièrement décrit. Nous présentons ici un protocole de collecte de P. embryons de hawaiensis et ablation manuelle d'un seul blastomère d'un embryon au stade de huit cellules. Le but de cette méthode est de parvenir à l'élimination complète du corps de la cellule de l'embryon, permettant l'observation des comportements cellulaires et les compétences du destin cellulaire des cellules restantes au cours de l'embryogenèse et le développement post-embryonnaire. Notre protocole montre l'enlèvement du précurseur g de la lignée germinale (figure 2C), mais peut être appliquée à n'importe quelle cellule au stade huit cellules, ou à des blastomères étapes de clivage précédents. En principe, ce protocole pourrait être appliquée pour éliminer les cellules individuelles à partir d'embryons à un stade préliminaire de clivage d'Other clivage holoblastically invertébrés marins.

Protocol

Les commentaires qui pourraient être utiles dans l'exécution de certaines mesures sont indiquées en italique. Une. Jour 1: Préparation des matériaux Préparer les documents suivants (voir le tableau des matériaux et de l'équipement): 15 cm et 22 cm de pipettes Pasteur Diamant scribe eau de mer artificielle filtrée (salinité entre 0,0018 à 0,0020) contenant 1 mg / ml d'amphotéricine B (1:100 d'une solution stock de 100 mg / ml), 100 unit?…

Representative Results

Après ablation réussie de seul troisième clivage P. micromères de hawaiensis comme décrit dans ce protocole, les micromères restants passent progressivement leurs positions légèrement de manière à occuper partiellement l'espace précédemment occupé par le blastomère ablation. Par exemple, lorsque g est retiré, le voisin blastomères MR et ML décaler légèrement et venez partager les bordures de cellules latérales qui étaient auparavant en contact …

Discussion

Nous décrivons un protocole pour l'ablation d'emploi et l'élimination physique complète de blastomères simples à partir des stades de clivage début de l'amphipode P. hawaiensis. Nous démontrons l'utilisation de ce protocole en supprimant la seule ligne de cellules germinales précurseur g à partir d'un embryon au stade de huit cellules, et montrons que l'ablation a été un succès en confirmant l'absence de cellules filles de g dans l&#3…

Materials

15 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-630	For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. VWR
22 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-632	For making mouth pipette tips. VWR
3 cm petri dishes	Thermo Scientific	25382-334	Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. VWR
48-well plates	Greiner Bio-One	82051-004	For culturing embryos following ablation. VWR
Bottle top filters 0.2 micron	Nalge Nunc International	28199-296	For creating FASW (See below) VWR
Bunsen burner	VWR	89038-530	For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. VWR
Diamond scribe	Musco Sports Lighting	52865-005	For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. VWR
Forceps	Fine Science Tools	11050-10	For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps – the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. Fine Science Tools
Fungizone-Amphotericin B	Sigma	A2942	Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. Sigma Aldrich
Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)	World Precision Instruments	1B100-4	need to include glass capillary and needle puller machine? World Precision Instruments
Glass watchglass 300 mm diameter	Electron Microscopy Sciences	70543-30	For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. Electron Microscopy Sciences
Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)	Instant Ocean	IS160	Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. Aquatic EcoSystems
Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)	Instant Ocean	IS160	Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. Aquatic EcoSystems
Kimwipes	Kimberly-Clark	21905-026	For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. VWR
Mouth pipette adaptor	Drummond Labware	A5177-5EA	Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. Sigma Aldrich
Mouth pipette tubing	Aldrich	Z280356	Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. Sigma Aldrich
Needle Puller	Sutter Instrument Company	P97	For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. Sutter Instrument Company
Penicillin-Streptomycin Solution	Mediatech	45000-650	Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. VWR
Rubber bulb	Electron Microscopy Sciences	100488-418	For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. VWR
Sylgard 184	K. R. Anderson, Inc.	NC9659604	Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. Fisher Scientific
Tungsten wire 0.004 inches diameter	A-M Systems	719000	Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. A-M Systems