O hawaiensis anfípode Parhyale é um organismo modelo promissor para estudos de embriologia e desenvolvimento crustáceo artrópodes comparativa e evolução. Este protocolo descreve um método para a remoção manual dos blastómeros individuais a partir de embriões de fase de clivagem precoces de Parhyale.
O hawaiensis anfípode Parhyale é um pequeno crustáceo encontrado em habitats marinhos intertidal em todo o mundo. Ao longo da última década, Parhyale emergiu como um organismo modelo promissor para estudos de laboratório de desenvolvimento, proporcionando uma comparação grupo externo útil para o modelo de artrópodes organismo bem estudado de Drosophila melanogaster. Em contraste com as clivagens sinciciais de Drosophila, os primeiros clivagens de Parhyale são holoblásticas. Mapeamento destino usando corantes traçadores injetados primeiros blastômeros têm mostrado que todas as três camadas germinativas e da linha germinal são estabelecidas pelo estágio de oito células. Nesta fase, três blastômeros estão fadados a dar origem ao ectoderma, três estão fadados a dar origem à mesoderme, e os restantes dois blastômeros são os precursores da linha endoderme e germe respectivamente. No entanto, as experiências de ablação blastômeros têm mostrado que os embriões Parhyale também possuem capabiliti regulador significativoes, de tal forma que os destinos de blastômeros cauterizado no estágio de oito células pode ser tomada pelos descendentes de alguns dos blastômeros restantes. Ablação blastomere tenha sido anteriormente descrita por um dos dois métodos: a injecção e a subsequente activação de corantes fototóxicas ou ablação manual. No entanto, fotoablação mata blastômeros, mas não remove o corpo de células mortas do embrião. Remoção física completa dos blastómeros específicos podem ser, por conseguinte, um método preferido de ablação para algumas aplicações. Aqui é apresentado um protocolo para a remoção manual dos blastómeros individuais a partir da fase de oito células de embriões Parhyale, ilustrando os instrumentos e procedimentos manuais necessárias para a remoção completa do corpo da célula, mantendo as restantes blastómeros viva e intacta. Este protocolo pode ser aplicado a qualquer célula Parhyale na fase de oito células, ou de blastómeros de outras fases de clivagem antecipada. Além disso, em princípio, este protocolo pode ser aplicável a clea precoceVåge embriões em estágio de outros invertebrados marinhos holoblastically clivagem.
O Parhyale hawaiensis anfípode crustáceo emergiu na última década como um organismo modelo promissor e com grande potencial para uso em pesquisa evolucionária biologia do desenvolvimento 1. Entre os artrópodes, a maioria dos sistemas modelo são insetos, e os mais extensivamente estudado delas é a mosca da fruta Drosophila melanogaster. D. melanogaster é um membro da ordem de insectos Diptera, e, como tal, apresenta muitas características da embriologia que são derivadas em relação aos dos insectos basalmente ramificação 2. Além disso, os insetos são aninhados dentro do subfilo Pancrustacea 3, o que significa que os insetos têm seus parentes mais próximos dentro do grupo "natural" de longa data chamado pancrustaceans, e que este grupo é parafilético. Isto sugere que, além de basally ramificação modelos de insetos, estudos de outros crustáceos são obrigados a ter uma visão mais ampla da história evolutiva das características do desenvolvimento de ummecanismos moleculares nd que foram muito bem estudados em D. melanogaster. No entanto, muito poucos crustáceos têm sido bem estabelecido para a análise de laboratório experimental de desenvolvimento. O anfípode P. hawaiensis é um sistema de modelo de laboratório altamente tratável, passíveis de uma variedade de técnicas experimentais. Amphipods exibir muitas características únicas dentro de sua superordem pai Peracarida (funis de praia, Scuds, e camarões bem), e, portanto, são pensados para ser relativamente derivado dentro deste grupo de crustáceos. No entanto, a relativa facilidade de manipulação genética embrionária e funcional oferecido pelo Parhyale fazer este anfípode uma adição valiosa para o estoque atual de organismos modelo.
Como um animal de laboratório, P. hawaiensis oferece muitas vantagens. Os animais são tolerantes a uma ampla gama de temperaturas e salinidades, e sobreviver bem em grandes culturas de água do mar artificial 1. É fácil de distinguir entre omeen homens e mulheres com base em diferenças morfológicas claras, principalmente, das grandes, em forma de gancho, apêndices tronco anterior que os machos usam para agarrar as fêmeas durante o acasalamento. Para o trabalho embrionário e de desenvolvimento, P. hawaiensis tem várias características muito atraentes. Embriogênese dura aproximadamente 10 dias eo tempo para a maturidade sexual é cerca de seis semanas a 28 º C (mas note que Parhyale sobrevive bem em temperaturas que variam de cerca de 20-30 º C, e que a informação detalhada encenação de desenvolvimento está disponível para os embriões criados a 18 º C 4 , 25 º C 4, e 26 º C 5,6). Adultos acasalar durante todo o ano no laboratório, por isso embriões estão disponíveis em qualquer época do ano. As fêmeas colocam 2-20 (dependendo da idade das fêmeas) ovos fecundados num marsúpios ventral situada entre os vários primeiros pares de pernas (Figuras 1A e 1B), e isto é possível reunir estas embriãos muito cedo no desenvolvimento sem matar a fêmea ou danificar os embriões (Figura 1C). Os embriões sobreviver em água do mar artificial filtrada através de incubação, pode ser fixado para a expressão do gene ou posterior análise histológica 7, e uma tabela de preparação detalhada permite a identificação precisa do progresso através do desenvolvimento 5. Protocolos robustos têm sido utilizados para realizar a análise de expressão gênica por hibridização in situ 8-15 ou imunomarcação 4,16,17, knockdown funcional por interferência de RNA 13,15 ou morpholinos 12, e germinal estável transgênese 18. Usando o sistema de transgénese, expressão indutível 14 e 19 armadilha potenciador métodos também podem ser utilizados para investigar a função de genes em P. hawaiensis. Enquanto a sequência do genoma disponível publicamente não está disponível atualmente, um transcriptoma contendo transcrições produzido durante a ovogênese e embriogênese tem abelhan de novo reunidos e anotados 20, e depositado em um banco de dados pesquisável 21, facilitando a descoberta do gene. Em suma, o P. hawaiensis é um organismo modelo altamente tratável adequado para múltiplas abordagens experimentais e genéticas para a compreensão do desenvolvimento.
Ao contrário das clivagens sinciciais de D. primeiros melanogaster, P. embriões hawaiensis clivar holoblastically após a fertilização (Figura 2A). Linhagem análise rastreio mostrou que a clivagem pela terceira, cada uma das terceira blastómeros de clivagem é especificamente destinada a dar origem a uma das três camadas germinais ou da linha germinal 6 (Figura 2B). Estes dados, juntamente com dados de microarranjos 22, linhagem de células analisa 6,23, e as experiências de isolamento de blastômeros 4 sugeriram que os potenciais de desenvolvimento são segregados para pelo menos alguns terceiros blastômeros de clivagem por herança assimétrica de cell determinantes sorte. Deste modo, em experiências de ablação blastómero na qual o precursor de linha germinal (denominado "g" no Parhyale linhagem celular nomenclatura 6) foi removida na fase de oito células, os embriões não tinham células germinais em quatro estágios de desenvolvimento posteriores, como indicado pela ausência de células expressando a proteína vasa, que é um marcador de linha germinal na maioria dos metazoários 24. Em contraste, as experiências de ablação blastômeros somáticas mostrou que P. embriões hawaiensis também possuem capacidades regulatórias significativas, de modo que os destinos de mesoderme ou ectoderma blastômeros precursoras cauterizado no estágio de oito células pode ser tomada pelos descendentes de alguns dos blastômeros restantes 25. Como substituição destino celular regulador pode ocorrer, ea extensão da adoção destino celular autônoma por blastômeros somáticas, permanece desconhecida. Técnicas embriológicas experimentais tais como a ablação blastomere pode ser útil em entending a autonomia relativa e nonautonomy de decisões destino de células 26,27 e são, portanto, de interesse no estudo da P. embriogênese hawaiensis.
Nos experimentos que demonstraram substituição regulador da ectodérmicas e mesodérmicas linhagens, ablação blastomere foi realizada pela injeção de 28 e excitação subseqüente de corantes phototoxic 25. Embora esta técnica seja eficaz em matar a blastomere injectado (s), que não remover completamente o corpo da célula morta do embrião. Além disso, foram observadas diferenças entre os dados de linhagem de células recolhidas nos estadios gastrulação da embriogênese, injetando blastômeros com traçadores fluorescentes linhagem 28,29, e os dados recolhidos pelo seguinte blastômeros não perturbados por meio do desenvolvimento das mesmas fases embrionárias 23. Remoção física completa dos blastómeros específicos podem ser, por conseguinte, um método preferido de ablação para algumas aplicações.
Nós já publicou os resultados de linhagem celular de embriões analisa em que células individuais foram extirpadas manualmente 23. No entanto, as operações delicadas necessárias para remover blastómeros individuais a partir de embriões na fase inicial de clivagem ainda não foram totalmente descritos. Aqui apresentamos um protocolo para coleta de P. embriões hawaiensis e ablação manual de um único blastômero de uma fase de embrião de oito células. O objectivo deste método é o de conseguir a remoção completa do corpo de célula do embrião, permitindo a observação dos comportamentos celulares e competências destino celular das células remanescentes durante a embriogénese e desenvolvimento pós-embrionário. Nosso protocolo mostra a remoção do precursor g linha germinal (Figura 2C), mas pode ser aplicado a qualquer célula na fase de oito células, ou para as fases de clivagem de blastómeros anteriores. Em princípio, este protocolo pode ser usado para remover as células individuais de embriões em estágio iniciais de clivagem outrr holoblastically clivagem invertebrados marinhos.
Nós descrevemos um protocolo para a ablação manual e remoção física completa de blastômeros individuais de estágios iniciais de clivagem da anfípode P. hawaiensis. Demonstramos uso deste protocolo, removendo a única linha germinal célula precursora g de uma fase de embrião de oito células, e mostrar que a ablação tem sido bem sucedida, confirmando a ausência de células-filhas g 's na embriogênese mais tarde. Este protocolo pode ser usada para remover qualq…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos Rayhan Arif e Hassaan Shahawy para trabalho de câmera, Tripti Gupta e Frederike Alwes de assistência refinar a técnica de ablação de células, e os membros do laboratório Extavour para feedback sobre os dados, vídeo e manuscrito. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Instituto de Células-Tronco de Harvard (Seed número Grant SG-0057-10-00) da Fundação Ellison Medical (New Scholar Award número AG-NS-07010-10) a CGE, e prêmios do Programa Escola de Pesquisa de Harvard para ARN.
15 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-630 | For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. VWR |
22 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-632 | For making mouth pipette tips. VWR |
3 cm petri dishes | Thermo Scientific | 25382-334 | Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. VWR |
48-well plates | Greiner Bio-One | 82051-004 | For culturing embryos following ablation. VWR |
Bottle top filters 0.2 micron | Nalge Nunc International | 28199-296 | For creating FASW (See below) VWR |
Bunsen burner | VWR | 89038-530 | For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. VWR |
Diamond scribe | Musco Sports Lighting | 52865-005 | For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. VWR |
Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps – the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. Fine Science Tools |
Fungizone-Amphotericin B | Sigma | A2942 | Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. Sigma Aldrich |
Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm) | World Precision Instruments | 1B100-4 | need to include glass capillary and needle puller machine? World Precision Instruments |
Glass watchglass 300 mm diameter | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. Electron Microscopy Sciences |
Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW) | Instant Ocean | IS160 | Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. Aquatic EcoSystems |
Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW) | Instant Ocean | IS160 | Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. Aquatic EcoSystems |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 21905-026 | For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. VWR |
Mouth pipette adaptor | Drummond Labware | A5177-5EA | Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. Sigma Aldrich |
Mouth pipette tubing | Aldrich | Z280356 | Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. Sigma Aldrich |
Needle Puller | Sutter Instrument Company | P97 | For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. Sutter Instrument Company |
Penicillin-Streptomycin Solution | Mediatech | 45000-650 | Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. VWR |
Rubber bulb | Electron Microscopy Sciences | 100488-418 | For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. VWR |
Sylgard 184 | K. R. Anderson, Inc. | NC9659604 | Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. Fisher Scientific |
Tungsten wire 0.004 inches diameter | A-M Systems | 719000 | Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. A-M Systems |