Ablación de una sola célula de ocho células de embriones de los crustáceos anfípodos<em> Parhyale hawaiensis</em

Summary

El hawaiensis anfípodo Parhyale es un organismo modelo prometedor para los estudios de embriología y desarrollo de artrópodos crustáceos comparativa y evolución. Este protocolo describe un método para la extracción manual de blastómeros individuales a partir de embriones en estadio de división primeros de Parhyale.

Abstract

El hawaiensis anfípodo Parhyale es un pequeño crustáceo que se encuentra en los hábitats marinos intermareales de todo el mundo. Durante la última década, Parhyale ha convertido en un organismo modelo prometedor para los estudios de laboratorio de desarrollo, proporcionando una comparación exogrupo útil al organismo bien estudiado modelo artrópodo Drosophila melanogaster. En contraste con las divisiones sincitiales de Drosophila, las primeras divisiones de Parhyale son holoblástica. Suerte de cartografía utilizando colorantes trazadores inyectados en primeros blastómeros han demostrado que las tres capas germinales y la línea germinal se establecen por la etapa de ocho células. En esta etapa, tres blastómeras están destinados a dar lugar a el ectodermo, tres están destinados a dar lugar al mesodermo, y los dos restantes blastómeros son los precursores de la línea de endodermo y el germen respectivamente. Sin embargo, los experimentos de ablación de blastómeros han demostrado que los embriones Parhyale también poseen capabiliti reglamentaria significativaes, de tal manera que el destino de los blastómeros ablación en la fase de ocho células pueden ser asumidas por los descendientes de algunos de los blastómeros restantes. La ablación de blastómeros ha sido previamente descrito por uno de dos métodos: la inyección y la posterior activación de colorantes fototóxicas o ablación manual. Sin embargo, fotoablación mata blastómeros, pero no elimina el cuerpo de células muertas del embrión. Eliminación física completa de blastómeros específicos puede por lo tanto ser un método preferido de la ablación para algunas aplicaciones. Aquí se presenta un protocolo para la extracción manual de blastómeros independientes, desde la fase de ocho células de embriones Parhyale, ilustrando los instrumentos y procedimientos manuales necesarias para la eliminación completa del cuerpo de la célula, manteniendo las restantes blastómeros vivo e intacto. Este protocolo se puede aplicar a cualquier célula Parhyale en la fase de ocho células, o para blastómeros de otras etapas de escisión temprana. Además, en principio, este protocolo podría ser aplicable a CLEA tempranaVåge embriones de otros invertebrados marinos holoblastically escisión.

Introduction

El Parhyale hawaiensis crustáceo anfípodo ha surgido en la última década como un organismo modelo prometedor con un gran potencial para su uso en la investigación evolutiva biología del desarrollo ^1. Entre los artrópodos, la mayoría de los sistemas de modelos son insectos, y las más estudiadas de ellas es la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. D. melanogaster es un miembro de la orden de insectos Diptera, y, como tal, muestra muchas características embriológicas que se derivan con respecto a los de los insectos basalmente ramificación ^2. Por otra parte, los insectos se anidan dentro del suborden Pancrustacea ^3, lo que significa que los insectos tienen sus parientes más cercanos en el grupo desde hace mucho tiempo "natural" llamados pancrustaceans, y que este grupo es parafilético. Esto sugiere que además de ramificaciones basales modelos de insectos, se requieren estudios de otros crustáceos de obtener una visión más amplia del historia de la evolución de los rasgos del desarrollo de unamecanismos moleculares nd que han sido tan bien estudiados en D. melanogaster. Sin embargo, son muy pocos los crustáceos han sido bien establecidos para el análisis de laboratorio experimental de desarrollo. El anfípodo P. hawaiensis es un sistema de modelo de laboratorio altamente manejable, susceptible de una serie de técnicas experimentales. Anfípodos muestran muchas características únicas dentro de su superorder padre Peracarida (tolvas de playa, scuds, y camarones así), y por lo tanto se cree que están relativamente derivada dentro de este grupo de crustáceos. Sin embargo, la relativa facilidad de la manipulación genética embriológico y funcional que ofrece Parhyale hacen de este anfípodo una valiosa adición al inventario actual de organismos modelo.

Como un animal de laboratorio, P. hawaiensis ofrece muchas ventajas. Los animales son tolerantes a una amplia gama de temperaturas y salinidades, y sobreviven bien en grandes cultivos de agua de mar artificial ^1. Es fácil distinguir entrmachos y hembras een basadas en las diferencias morfológicas claras, sobre todo, los grandes en forma de gancho, el tronco, los apéndices anteriores que los machos usan para agarrar a la hembra durante el apareamiento. Para el trabajo y de desarrollo embriológico, P. hawaiensis tiene varias características muy atractivas. La embriogénesis dura aproximadamente 10 días y el tiempo hasta la madurez sexual es de aproximadamente seis semanas a 28 º C (pero tenga en cuenta que Parhyale sobrevive bien a temperaturas que van desde aproximadamente 20 a 30 º C, y que la informacion de puesta en escena de desarrollo está disponible para los embriones planteadas a 18 º C ⁴ , 25 º C ^4, y 26 º C ^5,6). Los adultos se aparean durante todo el año en el laboratorio, por lo que los embriones están disponibles en cualquier momento del año. Las hembras ponen 2-20 (dependiendo de la edad de las mujeres) huevos fertilizados en una bolsa de la cría ventral situado entre los primeros pares de patas (Figuras 1A y 1B), y es posible reunir estos embrións muy temprano en el desarrollo sin matar a la hembra o dañar los embriones (Figura 1C). Los embriones sobreviven en agua de mar artificial se filtra a través de la eclosión, se pueden fijar para la expresión génica o posterior análisis histológico ^7, y una tabla de ensayo detallado permite la identificación precisa de los avances a través del desarrollo ^5. Protocolos robustos se han utilizado para realizar el análisis de la expresión génica mediante hibridación in situ ^8-15 o inmunotinción ^4,16,17, desmontables funcional mediante ARN de interferencia ^13,15 o morfolinos ^12, y la línea germinal estable transgénesis ^18. Usando el sistema de la transgénesis, la expresión inducible ¹⁴ y potenciador trampa ¹⁹ métodos también pueden utilizarse para investigar la función de genes en P. hawaiensis. Mientras que una secuencia del genoma a disposición del público no está disponible actualmente, un transcriptoma contiene transcripciones producido durante la ovogénesis y embriogénesis tiene abejan de novo montado y anotado ^20, y depositado en una base de datos ^21, facilitando el descubrimiento de genes. En suma, P. hawaiensis es un organismo modelo muy manejable adecuada para múltiples enfoques experimentales y genéticos para entender el desarrollo.

A diferencia de las primeras divisiones sincitiales de D. melanogaster, P. embriones hawaiensis escinden holoblastically después de la fertilización (Figura 2A). Linaje análisis de rastreo ha demostrado que por tercera división, cada uno de los tercero blastómeros de escisión está destinado específicamente para dar lugar a una de las tres capas germinales o la línea germinal ⁶ (Figura 2B). Estos datos, junto con los datos de microarrays ^22, linaje de células análisis ^6,23, y los experimentos de aislamiento blastómeras ⁴ han sugerido que los potenciales de desarrollo son segregados por lo menos a algunos terceros blastómeras la escisión por la herencia asimétrica de cell determinantes destino. En consecuencia, en los experimentos de ablación de blastómeros en el que se eliminó el precursor de línea germinal (denominado "g" en la Parhyale linaje de células nomenclatura ⁶⁾ en la etapa de ocho células, embriones carecían de células germinales en las etapas de desarrollo posteriores ^4, como se indica por la ausencia de células que expresa la proteína Vasa, que es un marcador de la línea germinal en la mayoría de los metazoos ^24. En contraste, los experimentos de ablación de blastómeros somáticas mostraron que P. embriones hawaiensis también poseen capacidades reguladoras importantes, que los destinos de mesodermo o ectodermo blastómeras precursoras ablación en la fase de ocho células pueden ser asumidas por los descendientes de algunos de los blastómeros restantes ^{de 25.} ¿Cómo puede ocurrir la sustitución del destino celular regulativo, y el grado de autonomía de adopción por el destino de las células somáticas blastómeras, sigue siendo desconocido. Técnicas embriológicas experimentales tales como la ablación de blastómeros pueden ser útiles en understanding la autonomía relativa y nonautonomy de las decisiones del destino celular ^26,27 y por lo tanto son de interés en el estudio de P. embriogénesis hawaiensis.

En los experimentos que demostraron reemplazo regulativa de ectodermo y mesodermo linajes, la ablación de blastómeros se realizó mediante inyección ²⁸ y la posterior excitación de tintes fototóxicas ^25. Si bien esta técnica es eficaz en matar el blastómero (s) se inyecta, no elimina completamente el cuerpo de células muertas del embrión. Además, se han observado diferencias entre los datos recogidos a través del linaje de células de las etapas de la embriogénesis gastrulación inyectando blastómeras con trazadores fluorescentes linaje ^28,29, y los datos recogidos siguiendo blastómeras no perturbadas por medio del desarrollo de las mismas etapas embrionarias ^23. Eliminación física completa de blastómeros específicos puede por lo tanto ser un método preferido de la ablación para algunas aplicaciones.

Hemos publicado anteriormente los resultados de los análisis de linaje de células de embriones en los que las células individuales se ablated manualmente ^23. Sin embargo, las operaciones delicadas requeridas para eliminar blastómeros individuales a partir de embriones de etapa de escisión primeros aún no se han descrito completamente. Aquí se presenta un protocolo para la recolección de P. embriones hawaiensis y ablación manual de una sola blastómeros de un embrión en su fase de ocho células. El objetivo de este método es para lograr la eliminación completa del cuerpo de la célula del embrión, lo que permite la observación de los comportamientos celulares y competencias destino celular de las células restantes durante la embriogénesis y el desarrollo de post-embrionario. Nuestro protocolo muestra la eliminación del precursor g línea germinal (Figura 2C), pero se puede aplicar a cualquier célula en la fase de ocho células, o para blastómeros de etapas de escisión anteriores. En principio, este protocolo se podría aplicar para eliminar las células individuales a partir de embriones en estadio de división primeros de Other escindir holoblastically invertebrados marinos.

Protocol

Los comentarios que pueden ser de ayuda en la ejecución de ciertas medidas se indican en cursiva. 1. Día 1: Preparación de Materiales Prepare los siguientes materiales (véase la Tabla de Materiales y Equipos): 15 cm y 22 cm pipetas Pasteur Escribano Diamond filtrada agua de mar artificial (salinidad entre 0,0018 a 0,0020) que contiene 1 mg / ml de anfotericina B (1:100 de una solución madre 100 mg / ml), 100 unidades / ml de penicilina y 100 mg / ml de estrep…

Representative Results

Después de la ablación con éxito del single tercera hendidura P. micrómeros hawaiensis como se describe en este protocolo, los micrómeros restantes cambian gradualmente sus posiciones ligeramente con el fin de ocupar parcialmente el espacio anteriormente ocupado por la ablación de blastómeros. Por ejemplo, cuando se elimina g, la vecina blastómeras MR y ML cambiar ligeramente y llegar a compartir los bordes de las celdas laterales que antes estaban en contacto …

Discussion

Se describe un protocolo para la ablación manual y eliminación física completa de blastómeros independientes de división etapas tempranas del anfípodo P. hawaiensis. Se demuestra el uso de este protocolo mediante la eliminación de la única línea germinal de células precursoras g de un embrión en su fase de ocho células, y demostrar que la ablación ha sido un éxito, al confirmar la ausencia de células hijas g 's en la embriogénesis después. Este protocolo se…

Materials

15 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-630	For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. VWR
22 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-632	For making mouth pipette tips. VWR
3 cm petri dishes	Thermo Scientific	25382-334	Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. VWR
48-well plates	Greiner Bio-One	82051-004	For culturing embryos following ablation. VWR
Bottle top filters 0.2 micron	Nalge Nunc International	28199-296	For creating FASW (See below) VWR
Bunsen burner	VWR	89038-530	For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. VWR
Diamond scribe	Musco Sports Lighting	52865-005	For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. VWR
Forceps	Fine Science Tools	11050-10	For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps – the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. Fine Science Tools
Fungizone-Amphotericin B	Sigma	A2942	Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. Sigma Aldrich
Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)	World Precision Instruments	1B100-4	need to include glass capillary and needle puller machine? World Precision Instruments
Glass watchglass 300 mm diameter	Electron Microscopy Sciences	70543-30	For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. Electron Microscopy Sciences
Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)	Instant Ocean	IS160	Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. Aquatic EcoSystems
Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)	Instant Ocean	IS160	Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. Aquatic EcoSystems
Kimwipes	Kimberly-Clark	21905-026	For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. VWR
Mouth pipette adaptor	Drummond Labware	A5177-5EA	Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. Sigma Aldrich
Mouth pipette tubing	Aldrich	Z280356	Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. Sigma Aldrich
Needle Puller	Sutter Instrument Company	P97	For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. Sutter Instrument Company
Penicillin-Streptomycin Solution	Mediatech	45000-650	Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. VWR
Rubber bulb	Electron Microscopy Sciences	100488-418	For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. VWR
Sylgard 184	K. R. Anderson, Inc.	NC9659604	Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. Fisher Scientific
Tungsten wire 0.004 inches diameter	A-M Systems	719000	Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. A-M Systems