Ablation von einer einzigen Zelle ab Acht-Zell-Embryonen der Amphipod Schalentier<em> Parhyale hawaiensis</em

Summary

Der Floh Parhyale hawaiensis ist eine vielversprechende Modellorganismus für die Untersuchung der Krustentier Embryologie und vergleichende Arthropoden Entwicklung und Evolution. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die manuelle Entfernung der einzelnen Blastomeren aus frühen Embryonen im Teilungsstadium von Parhyale.

Abstract

Der Floh Parhyale hawaiensis ist ein kleines Krustentier in Gezeiten marine Lebensräume weltweit gefunden. In den vergangenen zehn Jahren hat sich Parhyale als eine vielversprechende Modellorganismus für Laboruntersuchungen von Entwicklung entstanden, ein nützliches Fremdgruppe Vergleich zur bekannten Gliederfüßer Modellorganismus Drosophila melanogaster. Im Gegensatz zu den Syncytial-Spaltungen von Drosophila, sind die frühen Spaltungen von Parhyale holoblastisch. Fate Mapping mit Tracer-Farbstoffe in frühen Blastomeren injiziert haben gezeigt, dass alle drei Keimblätter und der Keimbahn werden von der Acht-Zell-Stadium etabliert. Zu diesem Zeitpunkt werden drei Blastomeren beschieden, die zu dem Ektoderm geben, drei sind dazu bestimmt, um die zu dem Mesoderm zu geben, und die verbleibenden zwei Blastomeren sind die Vorstufen von Endoderm und Keimbahn sind. Allerdings haben Blastomere Ablation Experimente gezeigt, dass Embryonen Parhyale signifikanten regulatorischen capabiliti besitzen auches ist, so dass die Schicksale der Blastomeren im Acht-Zell-Stadium abgetragen kann über von den Nachkommen der einige der verbleibenden Blastomeren entnommen werden. Injektion und die anschließende Aktivierung von phototoxischen Farbstoffe oder manuelle Abtragen: Blastomere Ablation wurde zuvor von einem von zwei Verfahren beschrieben worden. , Tötet jedoch photoablation Blastomeren jedoch nicht die toten Zellkörper aus dem Embryo zu entfernen. Vollständige physische Entfernung spezifischer Blastomeren kann daher ein bevorzugtes Verfahren zur Ablation für einige Anwendungen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die manuelle Entfernung von einzelnen Blastomeren aus dem Acht-Zell-Stadium des Embryos Parhyale, veranschaulicht, die Instrumente und manuellen Verfahren, die für die vollständige Entfernung der Zellkörper, während die übrigen Blastomeren lebendig und intakt. Das Protokoll kann auf jeden Parhyale Zelle im Achtzellstadium oder Blastomeren von anderen frühen Teilungsstadien angewendet werden. Darüber hinaus grundsätzlich Dieses Protokoll könnte für frühe Clea seinvage Embryonen anderer holoblastically Spaltung wirbellose Meerestiere.

Introduction

Der Flohkrebstier Parhyale hawaiensis hat sich in den letzten zehn Jahren als vielversprechende Modellorganismus mit großem Potenzial für den Einsatz in der evolutionären Entwicklungsbiologie Forschungs ¹ entstanden. Unter den Arthropoden, die meisten Modellsysteme sind Insekten, und die meisten von ihnen ausgiebig studiert ist die Taufliege Drosophila melanogaster. D. melanogaster ist ein Mitglied der Insektenordnung Diptera, und als solche zeigt viele embryologische Funktionen, die mit Bezug auf diejenigen der basal Verzweigungs ² Insekten abgeleitet sind. Darüber hinaus werden Insekten in der Unterabteilung Pancrustacea ³ verschachtelt, was bedeutet, dass Insekten haben ihre nächsten Verwandten in der langjährigen "natürliche" Gruppe namens pancrustaceans, und dass diese Gruppe paraphyletic. Dies deutet darauf hin, dass zusätzlich zu basal abzweigInsekten Modelle werden Studien von anderen Krebstieren erforderlich, um eine umfassendere Sicht der Evolutionsgeschichte der Entwicklungsmerkmale gewinnen einnd molekularen Mechanismen, die so gut in D. untersucht worden sind melanogaster. Aber nur sehr wenige Krebstiere sind gut für experimentelle Laboranalyse der Entwicklung etabliert. Der Floh P. hawaiensis ist ein sehr gefügig Labor Modellsystem zugänglich zu einer Reihe von experimentellen Techniken. Amphipoden zeigen viele einzigartige Features in ihre Mutter Peracarida Überordnung (Strand Trichter, Scud-Raketen, und auch Garnelen) und werden daher vermutlich relativ innerhalb dieser Gruppe von Krebstieren abgeleitet werden. Dennoch ist die relative Leichtigkeit der embryologischen und funktionellen genetischen Manipulation von Parhyale angeboten machen dieses Floh eine wertvolle Ergänzung zu den aktuellen Bestand von Modellorganismen.

Als Labortier, P. hawaiensis bietet viele Vorteile. Tiere sind tolerant zu einem breiten Spektrum von Temperaturen und Salzgehalte und gut überleben in großen Kulturen von künstlichem Meerwasser ^ein. Es ist leicht zu unterscheiden zw.een Männer und Frauen, die auf klaren morphologischen Unterschiede, vor allem, die großen, gehakt, Vorderrumpf Anhänge, die zu verwenden, um die Weibchen während der Paarung zu erfassen Männchen. Für embryologische und Entwicklungsarbeit, P. hawaiensis hat mehrere sehr ansprechende Features. Embryogenese dauert etwa 10 Tage und die Zeit bis zur Geschlechtsreife ist etwa sechs Wochen bei 28 º C (aber beachten Sie, dass Parhyale überlebt auch bei Temperaturen von ca. 20-30 ° C, und eine ausführliche Entwicklungs Inszenierung Informationen für Embryonen bei 18 º C ⁴ angehoben verfügbar , 25 ° C ⁴ und 26 º C ^5,6). Erwachsene passen das ganze Jahr über im Labor, so dass Embryonen sind zu jeder Zeit des Jahres zur Verfügung. Die Weibchen legen 2-20 (je nach dem Alter der Frau) befruchteten Eier in eine Bruttasche ventralen zwischen der ersten mehrere Paar Beine (1A und 1B) gelegen, und es ist möglich, diese zu sammeln Embryos sehr früh in der Entwicklung, ohne die weibliche Töten oder Beschädigung der Embryonen (Abbildung 1C). Die Embryonen überleben in künstlichem Meerwasser gefiltert bis zum Schlüpfen können für nachfolgende Genexpression oder histologische Analyse ⁷ festgelegt werden, und eine detaillierte Testtabelle ermöglicht eine genaue Identifikation der Fortschritt durch Entwicklung ^5. Robust Protokolle wurden zur Genexpressionsanalyse durch in situ Hybridisierung ^8-15 oder Immunfärbung ^4,16,17 durchzuführen, funktionelle Knockdown durch RNA-Interferenz oder ^13,15 morpholinos ^12, und stabile Keimbahntransgenese ^18. Verwendung der Transgenese System induzierbaren Expressionsverstärker ¹⁴ und ¹⁹ abzufangen Methoden können auch verwendet werden, um die Genfunktion in P. untersuchen hawaiensis. Während ein öffentlich verfügbaren Genomsequenz ist derzeit nicht verfügbar ist, enthält eine Transkriptom-Transkripte während der Oogenese und Embryogenese hergestellte Bienenn de novo und kommentierte ²⁰ und in einer durchsuchbaren Datenbank hinterlegt ^21, die Erleichterung Gen Entdeckung. Insgesamt P. hawaiensis ist ein sehr gefügig Modellorganismus geeignet für mehrere experimentelle und genetische Ansätze zum Verständnis der Entwicklung.

Im Gegensatz zu den frühen Syncytial-Spaltungen von D. melanogaster, P. hawaiensis Embryonen spalten holoblastically nach der Befruchtung (Abbildung 2A). Lineage Tracing Analyse hat gezeigt, dass durch die dritte Schnittstelle, wobei jede der dritten Spaltungs Blastomeren ist speziell dazu bestimmt, um die zu einem der drei Keimblätter oder die Keimbahn ⁶ (Fig. 2B) erhalten wurde. Diese Daten, zusammen mit Microarray-Daten ^22, Zelllinie analysiert ^6,23 und ⁴ Blastomere Isolationsexperimente haben vorgeschlagen, dass Entwicklungspotentiale sind getrennt, zumindest einigen Dritt Spaltung Blastomeren durch asymmetrische Vererbung von cell Schicksal Determinanten. Dementsprechend wird in Blastomere Ablation Experimenten, bei denen die Keimbahn-Vorstufe (im Parhyale Zelllinie ⁶ Nomenklatur als "g") wurde bei der acht Zellen-Stadium entfernt fehlte Embryonen Keimzellen in späteren Entwicklungsstadien ^4, wie durch die Abwesenheit von Zellen angegeben Expression des Proteins Vasa, die eine Keimbahnmarkierung in den meisten Metazoen ²⁴ ist. Im Gegensatz dazu zeigten die somatische Blastomere Ablation Experimente, dass P. hawaiensis Embryonen besitzen auch erhebliche regulatorische Fähigkeiten, so dass die Schicksale der Mesoderm oder Ektoderm Vorläufer Blastomeren im Acht-Zell-Stadium abgetragen kann über von den Nachkommen der einige der verbleibenden ²⁵ Blastomeren entnommen werden. Wie regulative Zellschicksal Austausch stattfinden kann, und das Ausmaß der autonomen Zellschicksal Annahme durch somatischen Blastomeren, bleibt unbekannt. Experimentelle embryologische Techniken wie Blastomere Ablation in under nützlich seinding die relative Autonomie und Unselbständigkeit des Zellschicksals ^26,27 Entscheidungen und sind daher von Interesse, die in der Studie von P. hawaiensis Embryogenese.

In den Experimenten, die regulative Ersatz von ektodermalen und mesodermalen Linien gezeigt wurde Blastomere Ablation durch Injektion ²⁸ und nachfolgende Anregung der Farbstoffe phototoxische ²⁵ durchgeführt. Während diese Technik effektiv bei der Abtötung der eingespritzten Blastomere (n) ist, ist es nicht völlig den toten Zellkörper aus dem Embryo zu entfernen. Außerdem wurden Unterschiede zwischen Zelllinie Daten bis zur Gastrulation Stufen der Embryogenese durch Injizieren Blastomeren mit fluoreszierenden Tracer Linie ^28,29 gesammelt, und Daten, die durch folgende ungestörten Blastomeren durch Entwicklung derselben Embryonalstadien ²³ gesammelt beobachtet. Vollständige physische Entfernung spezifischer Blastomeren kann daher ein bevorzugtes Verfahren zur Ablation für einige Anwendungen.

Wir haben vorher veröffentlicht die Ergebnisse der Zelllinie Analysen von Embryonen, in denen einzelne Zellen wurden manuell abgetragen ^23. Doch die zarten Operationen erforderlich, um einzelne Blastomeren vom frühen Embryonen im Teilungsstadium zu entfernen noch nicht vollständig beschrieben. Hier ein Protokoll für die Sammlung von P. präsentieren wir hawaiensis Embryonen und manuelle Ablation eines einzelnen Blastomeren aus einem Acht-Zell-Stadium Embryo. Das Ziel dieser Methode ist, um die vollständige Entfernung des Zellkörpers aus dem Embryo zu erreichen, so dass die Beobachtung der Zellverhalten und Zellschicksal Kompetenzen von den übrigen Zellen in der Embryogenese und post Embryonalentwicklung. Unser Protokoll zeigt die Entfernung von der Keimbahn-Vorläufer g (2C), aber kann auf jede beliebige Zelle in der Acht-Zellen-Stadium aufgebracht werden, oder Blastomeren früheren Teilungsstadien. Im Prinzip könnte dieses Protokoll angewandt, um einzelne Zellen aus frühen Embryonen im Teilungsstadium von othe entfernenr holoblastically Spaltung wirbellose Meerestiere.

Protocol

Kommentare, die hilfreich bei der Ausführung bestimmter Schritte sein können, sind in Kursivschrift angegeben. 1. Tag 1: Herstellung von Materialien Bereiten Sie die folgenden Materialien (siehe Tabelle der Materialien und Geräte): 15 cm und 22 cm Pasteur Pipetten Diamant-Schreiber gefiltert künstlichem Meerwasser (Salzgehalt zwischen 0,0018 bis 0,0020), die 1 mg / ml Amphotericin B (1:100 einer 100 mg / ml Stammlösung), 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 …

Representative Results

Nach der erfolgreichen Ablation von Einzel dritte Spaltung P. hawaiensis Mikromeren wie in diesem Protokoll beschrieben, nach und nach die restlichen Mikromeren ihre Positionen leicht verschieben, um so den Raum früher von der abgetragenen Blastomere besetzt teilweise zu besetzen. Zum Beispiel, wenn g wird entfernt, der benachbarten Blastomeren mr ml und leicht verschoben und kommen, um die seitlichen Zellgrenzen, die früher in direktem Kontakt mit g (vgl. <s…

Discussion

Wir beschreiben ein Protokoll für Hand Ablation und vollständige physische Entfernung der einzelnen Blastomeren vom frühen Teilungsstadien des Floh P. hawaiensis. Wir zeigen Verwendung dieses Protokolls durch Entfernen der einzelnen Keimbahn-Vorläuferzelle g aus einem Acht-Zell-Stadium Embryo, und zeigen, dass die Ablation wurde durch die Bestätigung Abwesenheit von g 's Tochter-Zellen in der Embryogenese später erfolgreich. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um …

Materials

15 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-630	For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. VWR
22 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-632	For making mouth pipette tips. VWR
3 cm petri dishes	Thermo Scientific	25382-334	Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. VWR
48-well plates	Greiner Bio-One	82051-004	For culturing embryos following ablation. VWR
Bottle top filters 0.2 micron	Nalge Nunc International	28199-296	For creating FASW (See below) VWR
Bunsen burner	VWR	89038-530	For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. VWR
Diamond scribe	Musco Sports Lighting	52865-005	For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. VWR
Forceps	Fine Science Tools	11050-10	For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps – the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. Fine Science Tools
Fungizone-Amphotericin B	Sigma	A2942	Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. Sigma Aldrich
Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)	World Precision Instruments	1B100-4	need to include glass capillary and needle puller machine? World Precision Instruments
Glass watchglass 300 mm diameter	Electron Microscopy Sciences	70543-30	For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. Electron Microscopy Sciences
Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)	Instant Ocean	IS160	Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. Aquatic EcoSystems
Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)	Instant Ocean	IS160	Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. Aquatic EcoSystems
Kimwipes	Kimberly-Clark	21905-026	For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. VWR
Mouth pipette adaptor	Drummond Labware	A5177-5EA	Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. Sigma Aldrich
Mouth pipette tubing	Aldrich	Z280356	Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. Sigma Aldrich
Needle Puller	Sutter Instrument Company	P97	For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. Sutter Instrument Company
Penicillin-Streptomycin Solution	Mediatech	45000-650	Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. VWR
Rubber bulb	Electron Microscopy Sciences	100488-418	For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. VWR
Sylgard 184	K. R. Anderson, Inc.	NC9659604	Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. Fisher Scientific
Tungsten wire 0.004 inches diameter	A-M Systems	719000	Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. A-M Systems