케토코나졸은 프레그난 X 수용체(PXR) 활성화에 결합하고 길항합니다. PXR 돌연변이의 효모 고처리량 스크리닝은 케토코나졸 결합을 위한 고유한 영역을 정의합니다. 이 효모 기반 유전 방법은 표면 결합 부위와 관련된 리간드와 새로운 핵 수용체 상호 작용을 발견합니다.
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방법 논문
포유류의 핵 수용체 잔류를 확인하기 위해 효모 두 하이브리드 시스템을 반전하는 리간드 및 / 또는 길항제와 상호 작용
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
약물 대사 및 염증의 중요한 조절 제로, Pregnane X 수용체 (PXR)는, 대사 및 염증 (예, 간 지방증) 1,2 연결 질병 병태 생리에서 중요한 역할을한다. PXR에 대한 효능 리간드의 식별에 많은 진전이 있었다, 그러나, 마약과 같은 길항제 및 PXR 3,4,5 그들의 결합 부위의 제한에 대한 설명이 있습니다. 중요한 장벽을 효율적으로 PXR는 1998 년에 복제 및 특징되었다는 사실에도 불구하고 길항제와 구조 연구에 대한 전체 길이의 단백질을 정화하는 무능력이다. 우리 연구소는 PXR 6 잔류 물을 결합, 길항제, 케토코나졸의를 정의하는 기반으로 소설 높은 처리량 효모 두 하이브리드 분석을 개발했다. 우리의 방법은 케토코나졸과 상호 작용 할 것으로 예상 PXR의 AF-2면에 하나의 돌연변이의 효과를 구출 할 돌연변이 라이브러리를 만드는 작업이 포함됩니다. 구조 또는 "기능 획득"세코ND 돌연변이 PXR에 케토코나졸의 유전 적 상호 작용과 표면 잔기 (들)에 관한 결론이 실현 가능하도록 만들어 질 수있다. 따라서, 우리는 그것의 보조 활성화, SRC-1과 상호 작용 PXR 돌연변이의 높은 처리량을 두 하이브리드 효모 화면을 개발했다. 효모는 항진균제, 케토코나졸의 연구를 수용하기 위해 수정 된이 방식을 사용하여, 우리는 케토코나졸에 바인딩 할 수 없습니다 클론 풍부한 PXR의 특정 변이를 설명 할 수 있습니다. 반대 논리에 의해, 우리는 원래의 잔류 케토코나졸과의 직접적인 상호 작용 잔류 있다는 결론을 내린다. 이 분석은 소설, 핵 수용체 길항제 표면에 결합 부위에 대한 화면으로 다루기 쉬운 유전자 분석을 나타냅니다. 이 분석은 효모뿐만 아니라 표준 구조 생물학 또는 단백체 기반 방법을 사용하여 연구 할 수없는 세포 단백질 (들)에 관계없이 세포 독성 가능성의 약물에 적용 할 수 있습니다. 잠재적 인 함정은 데이터의 해석 (보완적인 방법으로 유용), 신뢰성을 포함단일 Y2H 방법, 효모 처리 또는 효모 두 하이브리드 분석을 수행하는 전문 지식 및 분석 최적화에 ANCE.
서론
효모 2-하이브리드(Y2H) 분석은 단백질-단백질 상호 작용을 발견하는 데 널리 사용되며 최근에는 단백질-단백질 상호 작용 복합체 7, 8, 9, 10, 11을 방해하는 새로운 소분자를 발견하는 데 널리 사용됩니다. 그러나, 약물 발견 또는 "히트"에 사용되는 이 분석법의 기존 접근법은 단백질-단백질 표면 내에서 화학 화합물의 알로스테릭 상호 작용 잔류물을 검출할 수 없으며, 이는 변경될 때 여전히 상호 작용하고 변경된 잔기(11)에 대한 조사를 허용합니다. 실제로, 이러한 방법을 개발할 수 있다면 단백질-단백질 상호 작용 중단에 중요한 알로스테릭 상호 작용 잔류물의 높은 처리량 평가를 위한 다루기 쉬운 효모 시스템을 가능하게 할 것입니다. 신약 개발의 맥락에서 화합물과 단백질의 상호 작용을 확립하는 가장 직접적인 방법은 구조적 결정(예: 단백질 억제제 복합체의 결정화)을 포함합니다. 이러한 방법은 번거롭고 정교한 리소스를 사용하며 모든 단백질에 대해 구조 연구를 수행하는 것은 기술적으로 실현 가능하지 않습니다.
다루기 쉬운 유전 약물 스크리닝 시스템은 박테리아1, 2 및 포유류의 2 하이브리드와 같은 다른 모델 시스템에서 확립되었습니다. 그러나 이러한 시스템은 최적화....
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프로토콜
1. 효모 벡터에서 PXR 및 SRC-1 융합의 구성
- Human PXR LBD(107-434 아미노산) 및 Human SRC-1 full length(1-1401 아미노산)의 PCR 증폭.
- pSG5-hPXR 플라스미드8을 PXR LBD 템플릿으로 사용하고, pCMX-SRC1 플라스미드를 SRC-1 템플릿으로 사용합니다.
- PCR SuperMix, DNA 템플릿 및 프라이머(재료 참조)를 얼음에 보관하여 해동합니다.
- 0.25 μg/μl DNA 템플렛 1 μl, 10 mM 프라이머 쌍 각각 2 μl, PCR SuperMix 45 μl를 추가하고 H2O를 추가하여 총 부피를 50 μl로 만듭니다.
- PCR을 94°C에서 2분 동안 1사이클, 94°C에서 30초 동안 20사이클, 55°C에서 30초, 72°C에서 2분 동안 설정한 다음 72°C에서 1사이클로 10분 연장을 설정합니다. 1% 아가로스 겔로 PCR 산물을 확인합니다.
- Y2H 벡터로 복제하는 PCR 산물.
- 1% 아가로스 겔에서 PCR 산물을 정제합니다. BamHI 및 SalI를 사용하여 PXR, LBD, PCR 및 Y2H 벡터 pSH2-1....
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결과
PXR과 스테로이드 수용체 공동활성제-1(SRC-1)의 결합을 비색법으로 검출할 수 있는지 확인하기 위해 분석을 수행하였습니다. 효모는 스테롤 생산량이 상당하므로, 추가적인 외인성 리간드 없이도 효모 내 lacZ 발현이 유도될 수 있음이 이전에 밝혀진 바 있습니다. 분석 결과, PXR과 SRC-1이 형질전환된 효모 균주에서 lacZ 발현(청색 콜로니)이 유도되었으나, 공벡터(empty vector)만 또는 PXR이나 SRC-1만 개별적으로 형질전환된 효모에서는 LacZ 발현(백색 콜로니)이 유도되지 않았음을 확인하였습니다(Figure 3). 케토코나졸(25 μM)이 효모 내 PXR과 SRC-1의 상호작용을 방해하는지 판단하기 위해, 케토코나졸이 포함된 복제 플레이트를 니트로셀룰로오스와 X-gal 필터로 적신 후, 리프트(lift) 및 β-갈락토시다아제 액상 분석을 수행하였습니다. 복제 필터의 모든 콜로니가 백색으로 변한 것(이는 액상 효소 분석에서 β-갈락토시다아제 활성이 현저히 감소한 것으로도 확.......
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토론
수정된 Y2H 분석에서 PXR6에서 케토코나졸 상호작용에 대한 중요한 잔기를 확인했습니다. SRC-1은 공동활동제이기 때문에(그리고 pGADNot 벡터에 복제되었음), 우리는 또한 SRC-1이 pSH 벡터 시스템에 복제될 때 lacZ 발현을 활성화할 수 있는지 여부와 이것이 활성화 프로파일을 변경하거나 효모 2-하이브리드 분석의 누출에 영향을 미치는지 여부를 테스트했습니다. 재설계된 플라스미드를 사용하여 erg3Δ/erg11Δ 효모에서 2가지 하이브리드 분석을 수행했습니다. 이전과 마찬가지로, 우리는 lacZ 발현(파란색 콜로니)이 PXR 및 SRC-1로 형질전환된 erg3Δ/erg11Δ 효모 균주에서도 유도된다는 것을 보여줍니다. 그러나 빈 벡터, PXR 또는 SRC-1로 개별적으로 형질전환된 효모에서 LacZ 발현(백색 콜로니)의 유도는 없습니다(데이터는 표시되지 않음). 우리의 접근법은 기존의 구조 생물학 및/또는 단백질체 접근법에 순응할 .......
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공개 사항
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
감사의 글
이 연구는 미국 국립보건원(NIH) 보조금 CA127231 및 Damon Runyon Foundation Clinical Investigator Award(CI 1502)(S.M)의 지원을 받았습니다. 체코 공화국 Palacky University Olomouc의 Zdenek Dvorak 교수에게 이 기술을 기관에 이식하고 프로토콜의 표준화를 논의하는 데 도움이 되는 통찰력을 제공해 주신 것에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 효모 균주 CTY10-5d erg3Δ/erg11Δ | 우리 연구실 | CTY10-5d 효모는 ERG3 및 ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) 유전자6 . | |
| YPD 성장 매체 | BD Biosciences | 630409 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) w/o 아미노산 및 황산암모늄 | BD Biosciences | 233520 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| CSM-His/-Leu Complete Supplement Mixture | MP Biomedicals | 4250-412 | |
| ONPG (o-니트로페닐 &베타;-D-갈락토피라노시드). | Sigma-Aldrich | N1127 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Luria Broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| X-Gal | Fisher | BP-1615 | |
| 초음파 연어 정자 DNA 삶은 (10 mg/ml) | Life Technology | 156-017 | |
| 암피실린 | 아크로스 유기물 | 61177 | |
| 케토코나졸 | 시그마-알드리치 | K1003 | |
| N,N-디메틸포름아미드 | 아크로스 유기물 | 326871000 | |
| 리튬 아세테이 | 시그마-알드리치 | L4158 | |
| 50% PEG-3350 용액, 필터 멸균 | 시그마-알드리치 | P-3640 | |
| 니트로셀룰로오스 멤브레인 | Whatman | 10402091 | |
| 10cm 페트리 접시 | Fisher | 875712 | |
| 5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3' | 우리 연구소 | PXR LBD 포워드 프라이머 pSH2-1 | |
| 5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3' | 우리 연구소 | PXR LBD 리버스 프라이머 for pSH2-1 | |
| 5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGGGACAGTTCATCC -3' | 우리 연구소 | SRC-1 포워드 프라이머 pGADNOT | |
| 5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3' | 우리 실험실 | SRC-1 리버스 프라이머 pGADNOT | |
| 플래티넘 PCR 슈퍼믹스 | Invitrogen | 11306-016 | |
| BamHI | 우리 실험실 | R0136 | |
| SalI | 우리 실험실 | R0138 | |
| NotI | 우리 실험실 | R0189 |
참고문헌
- Kliewer, S. A., et al. An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway. Cell. 92 (1), 73-82 (1998).
- Blumberg, B., et al. a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor. Genes Dev. 12
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재인쇄 및 허가
