Invierta levadura de dos sistema híbrido para identificar mamíferos Receptor Nuclear Residuos que interactúan con ligandos y / o antagonistas

Summary

El ketoconazol se une a y antagoniza pregnano X activación del receptor (PXR). De levadura de alto rendimiento pantallas de mutantes PXR definen una región única para la unión ketoconazol. Este método de genética de la levadura descubre la interacción del receptor nuclear novedosas con ligandos que se asocian con los sitios de unión de la superficie.

Abstract

Como un regulador crítico de la inflamación y el metabolismo de fármacos, pregnano receptor X (PXR), juega un papel importante en la fisiopatología de la enfermedad que une el metabolismo y la inflamación (por ejemplo, la esteatosis hepática) ^1,2. Ha habido muchos avances en la identificación de ligandos agonistas de PXR, sin embargo, hay descripciones limitadas de antagonistas similares a las drogas y sus sitios de unión en PXR ^3,4,5. Un obstáculo fundamental ha sido la incapacidad para purificar eficientemente la proteína de longitud completa para estudios estructurales con antagonistas a pesar de que PXR se clonó y caracterizó en 1998. Nuestro laboratorio desarrolló una nueva levadura de alto rendimiento basado en dos híbridos de ensayo para definir un antagonista, ketoconazol de, residuos de unión en PXR ^6. Nuestro método implica la creación de bibliotecas mutacionales que rescatar el efecto de mutaciones individuales en la superficie de AF-2 de PXR espera que interactúe con ketoconazol. Rescate o "ganancia de función" second mutaciones pueden realizarse de tal manera que las conclusiones relativas a la interacción genética de ketoconazol y el residuo (s) de superficie en PXR son factibles. Por lo tanto, hemos desarrollado una evaluación de la levadura de dos híbridos de alto rendimiento de mutantes PXR que interactúan con su coactivador, SRC-1. El uso de este enfoque, en el que se modificó la levadura para acomodar el estudio del fármaco antifúngico, ketoconazol, hemos podido demostrar mutaciones específicas en PXR enriquecidos en los clones incapaces de unirse al ketoconazol. Por lógica inversa, llegamos a la conclusión de que los residuos originales son residuos de la interacción directa con ketoconazol. Este ensayo representa una novela, ensayo genético manejable para detectar sitios de unión sobre las superficies antagonistas de receptores nucleares. Este ensayo podría aplicarse a cualquier fármaco, independientemente de su potencial citotóxico a la levadura, así como a la proteína (s) celular que no pueden ser estudiados utilizando la biología estructural estándar o métodos proteómicos basada. Peligros potenciales incluyen la interpretación de los datos (métodos complementarios de utilidad), relición en un solo método Y2H, experiencia en el manejo de la levadura o la realización de dos ensayos de híbridos de levadura, y la optimización del ensayo.

Introduction

La levadura de dos híbridos (Y2H) de ensayo es ampliamente utilizado para descubrir las interacciones proteína-proteína y, más recientemente, para el descubrimiento de nuevas moléculas pequeñas que alteran los complejos proteína-proteína de interacción ^{7, 8, 9, 10, 11.} Sin embargo, los enfoques convencionales de este ensayo, que se utiliza para la detección de drogas o "hits", no permiten la detección de residuos de interacción alostéricos de compuestos químicos en las superficies de la proteína-proteína, que cuando se alteran aún interactuar y permitir el interrogatorio de los residuos alterados ¹¹ . De hecho, un método (s) de tal manera, si es factible desarrollar, permitiría un sistema de levadura manejable para la evaluación de alto rendimiento de los residuos de interacción alostéricos críticos para la proteína-proteína interacción interrupción. En el contexto del descubrimiento de fármacos, la forma más directa para establecer la interacción de los compuestos con proteínas implicaría la determinación estructural (por ejemplo, cristalización del complejo de proteína-inhibidor). Estos métodos son cumbersome, utilizar los recursos elaborados y que no sea técnicamente factible realizar estudios estructurales de cada proteína.

Sistemas de detección de drogas genética tratable se han establecido en las bacterias ^{1, 2} y otros sistemas modelo, como los mamíferos de dos híbridos. Sin embargo, estos sistemas necesitan optimización y sistemas alternativos como Y2H siguen siendo los más probado en el descubrimiento de fármacos. Hay limitaciones que incluyen poca sensibilidad y fiabilidad de las interacciones utilizando métodos singulares ^13, sin embargo, un único ensayo Y2H puede ser modificado para responder a preguntas específicas respecto a los residuos de interacción. En el campo de la investigación de los receptores nucleares, Y2H se ha utilizado para definir las proteínas que interactúan ^14, sin embargo, estas interacciones proteína rara vez se han utilizado para definir la naturaleza en el que los ligandos / antagonistas interactúan con complejos de proteína de receptor nuclear. Por lo tanto, nuestro laboratorio se centró esfuerzos en la definición de un método, especialmente para proteínas receptoras que no estánque se presta fácilmente a proteómicos métodos basados, eso sería desenterrar nuevo ligando / antagonista interactuar residuos utilizando una plataforma de descubrimiento Y2H basado inversa.

Basándonos en nuestra anterior conclusión de que el ketoconazol altera PXR y su activador SRC-1, hemos desarrollado un novedoso sistema de reversa Y2H que nos permiten definir e interrogar a los residuos de ketoconazol interactuar en PXR ^6. Nuestro método se basa en las propiedades de la proteína GAL4 de levadura que consiste en dominios separables responsables de la activación de unión a ADN y la transcripción. La proteína PXR LBD se expresa como una fusión con el dominio de unión a ADN LexA (ADN-BD), mientras que la longitud total co-activadores SRC-1 (coactivador del receptor de esteroides 1) las proteínas se expresan como fusiones al dominio de activación de GAL4 (AD ). Interacción entre PXR y SRC-1 proteínas de fusión conduce a la activación transcripcional de los sitios de unión de GAL4-que contiene el gen reportero de β-Lac Z que está integrado en el Genom levadurae. Ketoconazol, un antagonista de PXR, interrumpe PXR y SRC-1 interacción ^{15, 16, 17} y que puede detectar la interacción de PXR y SRC-1 en presencia o ausencia de ketoconazol después de la tinción colonias sobre filtros para la actividad de X-gal. El principio de Y2H se ilustra en la Figura 1 y el procedimiento experimental se resume en la Figura 2.

Protocol

1. Construcción de PXR y SRC-1 Las fusiones en vectores de levadura La amplificación por PCR de humano PXR LBD (107-434 aminoácidos) y SRC-1 humano de longitud completa (aminoácidos 1 a 1401). Utilice pSG5-hPXR plásmido 8 como plantilla PXR LBD, utilizar plásmido pCMX-SRC1 como SRC-1 plantillas. Descongele la PCR Supermix, plantillas de ADN y cebadores (ver Materiales), mantenerlos en hielo. Añadir 0,25 g / l de ADN plantilla 1 l, 10 mM de pares de cebadores 2 l …

Representative Results

Se realizó un ensayo para ver si podíamos detectar una lectura colorimétrica de la asociación de PXR y receptor de esteroides coactivador-1 (SRC-1). Dado que la levadura tiene una producción significativa de esterol, que previamente se ha demostrado que la expresión de lacZ en la levadura puede ser inducida sin la necesidad de ligando exógeno adicional. Hemos encontrado que la expresión de lacZ (colonias azules) también es inducida en la cepa de levadura transformada con PXR y SRC-1, sin embargo, no hay inducci…

Discussion

En nuestro ensayo Y2H modificado, hemos identificado los residuos importantes para las interacciones ketoconazol sobre PXR ^6. Desde SRC-1 es un coactivador (y se clonó en el vector de pGADNot), también a prueba si SRC-1 podría activar la expresión de lacZ cuando se clona en el sistema de vector PSH y si esto cambiaría el perfil de activación y / o afectar a la permeabilidad de el ensayo de dos híbridos de levadura. Uso de nuestros plásmidos rediseñados que llevamos a cabo dos ensayos de híbridos en …

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast Strain CTY10-5d erg3Δ/erg11Δ	Our lab		CTY10-5d yeast was double knocked out ERG3 and ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) genes6 .
YPD Growth Medium	BD Biosciences	630409
Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate	BD Biosciences	233520
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
CSM-His/-Leu Complete Supplement Mixture	MP Biomedicals	4250-412
ONPG (o-Nitrophenyl Β-D- Galactopyranoside).	Sigma-Aldrich	N1127
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
Luria Broth (LB)	Sigma-Aldrich	L3022
X-Gal	Fisher	BP-1615
Sonicated Salmon Sperm DNA boiled (10 mg/ml)	Life Technology	156-017
Ampicillin	Acros Organics	61177
Ketoconazole	Sigma-Aldrich	K1003
N,N-Dimethylformamide	Acros Organics	326871000
Lithium Acetate	Sigma-Aldrich	L4158
50% PEG-3350 solution, filter-sterilized	Sigma-Aldrich	P-3640
Nitrocellulose Membrane	Whatman	10402091
10 cm Petri Dish	Fisher	875712

5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3'	our lab		PXR LBD forward primer for pSH2-1
5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'	our lab		PXR LBD reverse primer for pSH2-1
5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3'	our lab		SRC-1 forward primer for pGADNOT
5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'	our lab		SRC-1 reverse primer for pGADNOT
Platinum PCR Supermix	Invitrogen	11306-016
BamHI	our lab	R0136
SalI	our lab	R0138
NotI	our lab	R0189