الثقافة الأولية من الإنسان الدهليزي Schwannomas
Summary
الدهليزي Schwannomas (VSS) هي أورام غير خبيثة من خلية شوان (SC) الأصل، ويرتبط مع طفرات في الجينات الكابتة للورم NF2. نحن الإبلاغ عن استنساخه، بروتوكول فعالة لالإنسان الأساسية VS ثقافة الخلية التي تسمح للتلاعب التجريبية الجزيئية والخلوية والتحليل ويلخص طبيعة غير متجانسة من الأمراض التي تصيب البشر.
Abstract
schwannomas الدهليزي (VSS) تمثل خلية شوان (SC) أورام العصب الدهليزي، المساومة 10٪ من جميع الأورام داخل الجمجمة. VSS تحدث في (نوع الورم العصبي الليفي 2، NF2) أشكال إما متفرقة أو العائلية، سواء المرتبطة تعطيل عيوب في الكابتة للورم NF2 الجينات. العلاج لVSS عموما استئصال الجراحي أو الشعاعية، ولكن الاعتلال مثل هذه الإجراءات قد قاد التحقيقات في علاجات أقل الغازية. تاريخيا، وعدم الحصول على عينات أنسجة جديدة، وحقيقة أن الخلايا شفاني لا خلد أعاقت بشكل كبير من استخدام الثقافات الأولية للتحقيق في شفاني تكون الأورام. للتغلب على إمدادات محدودة من الثقافات الأولية، تم إنشاء خط الخلية HEI193 VS خلده تنبيغ مع فيروس الورم الحليمي البشري E6 E7 والجينات المسرطنة. أدخلت هذه التعديلات أنكجنيك تنبيغ الجزيئية والمظهري كبيرة في الخلايا، والتي تحد من استخدامها كنموذج ليالي الإنسانالأورام chwannoma. وبالتالي فإننا توضيح مبسط، بروتوكول استنساخه لثقافة الإنسان الأساسية VS الخلايا. يتقن هذه التقنية بسهولة يسمح للتحقيقات الجزيئية والخلوية التي ألخص أكثر دقة تعقيد المرض VS.
Introduction
schwannomas الدهليزي (VSS) تمثل خلية شوان (SC) أورام العصب الدهليزي، المساومة 10٪ من جميع الأورام داخل الجمجمة 1-3. VSS تحدث في (نوع الورم العصبي الليفي 2، NF2) أشكال إما متفرقة أو العائلية، سواء المرتبطة تعطيل عيوب في الكابتة للورم NF2 الجينات. العلاج لVSS عموما استئصال الجراحي أو الشعاعية، ولكن الاعتلال مثل هذه الإجراءات تشمل الصمم، واعتلال الأعصاب في الوجه، وتسرب السائل الشوكي، وعدم التوازن، وإعادة نمو الورم 1. بالإضافة إلى ذلك ليس كل المرضى المرشحين الجراحية أو الإشعاع مقبولة. مثل قسط كبير من المراضة وكذلك عدم وجود العلاجات البديلة قد قاد التحقيق في البيولوجيا الجزيئية فريدة من VSS أملا في تطوير علاجات جديدة 3،4.
يسمح زراعة الخلايا لتحليلها السريع، السهل، ومتعمقة للسلوك الجزيئية والخلوية وفحص كوم العلاجية المحتملةجنيه. تاريخيا، وعدم الحصول على عينات أنسجة جديدة، وحقيقة أن الخلايا شفاني لا خلد أعاقت بشكل كبير من استخدام الثقافات الأولية للتحقيق في شفاني تكون الأورام. للتغلب على إمدادات محدودة من الثقافات الأولية، تم إنشاء خط الخلية HEI193 VS خلده تنبيغ مع فيروس الورم الحليمي البشري E6 E7 والجينات المسرطنة 5. أدخلت هذه التعديلات أنكجنيك تنبيغ الجزيئية والمظهري كبيرة في الخلايا، والتي تحد من استخدامها كنموذج للأورام شفاني الإنسان. SC الثقافات المستمدة من خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تفتقر إلى الجين NF2 وظيفية تمثل بديلا آخر للتحقيق NF2 التي تعتمد SC تكون الأورام في المختبر. ولكن هذه الثقافات تفشل في ألخص طبيعة غير متجانسة من VSS الإنسان أو حساب لسلوك معين الإنسان. معظم تقنيات الثقافة VS السابقة المطلوبة أوقات المعالجة طويلة نسبيا ومعقدة تقنيات ثقافة انتقائية 6-8.هنا نقدم، بروتوكول بسيط لاستنساخه الأولية VS ثقافة الخلية مع معالجة كاملة في أقل من 3 دقائق، مع 95٪ النقاء الخلية السرطانية على النحو الذي يحدده المناعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تاريخ الثقافات في المختبر شفاني
بدأت الجهود الرامية إلى إنشاء المختبر في الثقافات شفاني فقط بضعة عقود بعد بأورام في العصب السمعي الأولي وقعت استئصال الجراحي المفتوحة في عام 1894 12. كانت الثقافات سجلت أول م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الدعم: NIDCD R01DC009801، P30DC010362، 5T32DC000040-17
Materials
| Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution | Sigma | P4957 | Cell Culture Surface Treatment |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017-015 / L2020 | Cell Culture Surface Treatment |
| 0.2% Collagenase (dissolved in HBSS -/-) | Sigma | C2674 | Dissociation Reagent |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | Dissociation Reagent |
| TPS 100mm Round Culture Dish | Midwest Scientific | TP93100 | |
| Permanox 4 well slide | Fisher Scientific | 1256521 | |
| Permanox 8 well slide | Fisher Scientific | 1256522 | |
| Suction Filter Flask | Midwest Scientific | TP99500 | |
| 15ml Conical Tube | Midwest Scientific | TP91015 | |
| 50ml Conical Tube | Midwest Scientific | TP91050 | |
| 2mL Round Bottom Tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Small Scissor | FST | 14058-11 | |
| Small Forceps | FST | 11251-20 | |
| Scalpel Handle | FST | 10004-13 | |
| #11 Scalpel Blade | Roboz | RS-9801-11 | |
| Non-Tissue Culture 100mm Round Petri Dish | Fisher Scientific | 50-820-904 | |
| P1000 Pipetteman | Bioexpress | P3963-1000 | |
| Serological Pipetteman | Bioexpress | R3073-2P | |
| Sterile, Non-Filtered P1000 Pipette Tips | Midwest Scientific | TD1250R | |
| Insulated Ice Cooler | |||
| Culture Hood | Baker | ||
| Centrifuge | Eppendorf -5810R | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) +/+ (w/ Ca2+, Mg2+) | Gibco | 24020-117 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) -/- (w/out Ca2+, Mg2+) | Gibco | 14170-112 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red | Gibco | 11965-092 | Schwannoma Culture and Media Components |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-163 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Bovine Insulin (1mg/ml 200x) | Sigma | I6634 | Schwannoma Culture and Media Components |
References
- Arthurs, B. J., et al. A review of treatment modalities for vestibular schwannoma. Neurosurg Rev. 34 (3), 265-277 (2011).
- Evans, G. R., Lloyd, S. K., Ramsden, R. T. Neurofibromatosis type 2. Adv Otorhinolaryngol. 70, 91-98 (2001).
- Fong, B., et al. The molecular biology and novel treatments of vestibular schwannomas. J Neurosurg. 115 (5), 906-914 (2011).
- Jacob, A., et al. Preclinical validation of AR42, a novel histone deacetylase inhibitor, as treatment for vestibular schwannomas. Laryngoscope. 122 (1), 174-189 (2012).
- Evans, D. G. Neurofibromatosis 2 [Bilateral acoustic neurofibromatosis, central neurofibromatosis. NF2, neurofibromatosis type II]. Genet Med. 11 (9), 599-610 (2009).
- Anniko, M., Noren, G. The Human Acoustic Neurinoma in Organ-Culture .1. Methodological Aspects. Acta Oto-Laryngologica. 91 (1-2), 47-53 (1981).
- Manent, J., et al. Magnetic cell sorting for enriching Schwann cells from adult mouse peripheral nerves. J Neurosci Methods. 123 (2), 167-173 (2003).
- Nair, S., et al. Primary cultures of human vestibular schwannoma: selective growth of schwannoma cells. Otol Neurotol. 28 (2), 258-263 (2007).
- Baur, A. M., et al. Laminin promotes differentiation, adhesion and proliferation of cell cultures derived from human acoustic nerve schwannoma. Acta Otolaryngol. 115 (4), 517-521 (1995).
- Cravioto, H., et al. Experimental neurinoma in tissue culture. Acta Neuropathol. 21 (2), 154-164 (1972).
- Kaasinen, S., et al. Culturing of acoustic neuroma–methodological aspects. Acta Otolaryngol Suppl. 520 Pt 1, 25-26 (1995).
- Kredel, F. E. Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas. Am J Pathol. 4 (4), 337-340 (1928).
- Murray, M. R., Stout, A. P., Bradley, C. F. Schwann cell versus fibroblast as the origin of the specific nerve sheath tumor: Observations upon normal nerve sheaths and neurilemomas in vitro. Am J Pathol. 16 (1), 41-60 (1940).
- Cravioto, H., Lockwood, R. The behavior of acoustic neuroma in tissue culture. Acta Neuropathol. 12 (2), 141-157 (1969).
- Lee, J. D., et al. Genetic and epigenetic alterations of the NF2 gene in sporadic vestibular schwannomas. PLoS One. 7 (1), 30418 (2012).
- Wippold, F. J., 2nd, , et al. Neuropathology for the neuroradiologist: Antoni A and Antoni B tissue patterns. AJNR Am J Neuroradiol. 28 (9), 1633-1638 (2007).
- Mennel, H. D. Short-term tissue culture observations of experimental primary and transplanted nervous system tumors. J Neuropathol Exp Neurol. 39 (6), 639-660 (1980).
- Rosenbaum, C., et al. Isolation and characterization of Schwann cells from neurofibromatosis type 2 patients. Neurobiol Dis. 5 (1), 55-64 (1998).
