Een orthotope Glioblastoma Muis Model Handhaving Brain Parenchymale fysieke beperkingen en geschikt voor intravitale twee-foton microscopie
Summary
We hebben een corticaal orthotope glioblastoom model vastgesteld muizen intravitale twee-foton microscopie dat de biofysische beperkingen recapituleert beginsel zullen spelen tijdens de groei van de tumor. Een chronische glazen venster vervangen van de schedel boven de tumor kan de follow-up van de progressie van de tumor na verloop van tijd door twee-foton microscopie.
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM) is de meest agressieve vorm van hersentumoren zonder curatieve behandelingen beschikbaar tot op heden.
Murine modellen van deze pathologie vertrouwen op de injectie van een suspensie van glioma cellen in het hersenparenchym na incisie van de dura mater. Dat de cellen te oppervlakkig worden geïnjecteerd toegankelijk intravitaal twee-foton microscopie zijn, oppervlakkige injecties niet aan de fysiopathologische omstandigheden recapituleren. Inderdaad, het ontsnappen door de injectie-darmkanaal meest tumorcellen bereikt de extra-durale ruimte waar ze uitbreiden abnormaal snelle in afwezigheid van mechanische beperkingen van het parenchym.
De verbeteringen omvatten niet alleen focaal implanteren glioom sferoïde dan injecteren van een suspensie van glioma cellen in de oppervlakkige lagen van de cerebrale cortex, maar ook verstopping van de injectieplaats met een verknoopte dextran-gel hemi kraal die is vastgelijmd aan het surrounding parenchym en verzegeld tot dura-mater met cyanoacrylaat. Al met al deze maatregelen af te dwingen van de fysiologische uitbreiding en infiltratie van de tumorcellen in de hersenen parenchym. Craniotomie werd uiteindelijk afgesloten met een glazen venster gecementeerd aan de schedel om chronische beeldvorming gedurende weken staan in afwezigheid van littekenweefsel ontwikkeling.
Gebruikmakend van TL geënt met fluorescerende tumorcellen hebben we aangetoond dat de dynamiek van interacties die tussen glioma cellen, neuronen (bijv. Thy1-GVB muizen) en bloedvaten (gemarkeerd door een intraveneuze injectie van een fluorescente kleurstof) kan worden gevisualiseerd door intravitale transgene dieren twee-foton microscopie tijdens de progressie van de ziekte.
De mogelijkheid om een beeld van de tumor bij microscopisch resolutie in een minimaal aangetast cerebrale omgeving betekent een verbetering van de huidige GBM diermodellen die het gebied van neuro-oncologie en drugstesten moeten profiteren. </p>
Introduction
Glioblastoma multiforme verschijnt als de meest agressieve vorm van hersentumoren bij volwassenen met een mediane overleving van 12 maanden en een 5-jaar overleving tarief van 5%. Klinische beheer voert chirurgie, radiotherapie en chemotherapie vaak in combinatie. Echter, de effecten van deze behandelingen blijven palliatieve 1-3.
Tot nu zijn de meeste van neuro-oncologie onderzoeken afhankelijk technieken die alleen in staat om een statische weergave verschaffen en uitgevoerd op grote cohorten van tumordragende dieren gedood op verschillende tijdstippen (zie bijvoorbeeld 4,5). De recente ontwikkeling van follow-up methoden op basis intravitale beeldvorming kan bestuderen groei glioom en de interacties tussen tumorcellen en hun pathofysiologische micromilieu op hetzelfde dier tijd. Dit opent de weg naar exclusieve stukje informatie dat tot nu toe onbereikbaar 6 was. Transgene dieren uiten fluorescerende tags in cellen van belang kan gebruik wordend om specifieke interacties tussen tumorcellen en bijvoorbeeld neuronen in dit document bestuderen.
In het afgelopen decennium, heeft intravitale twee-foton microscopie 7 uitgegroeid tot een gouden standaard in fundamentele neuro-oncologie onderzoek en preklinische proeven 8,9 voor haar vermogen om diep intravitale observatie van de hersenen van muizen te voeren (> 500 micrometer onder de dura-mater) met een micrometrisch ruimtelijke resolutie 10. Met intravitaal twee-foton microscopie met orthotopical diermodellen geïmplanteerd met een chronische craniale venster 11 is het mogelijk om de tumor progressie in de tijd op dezelfde muis 9,12 volgen.
Een van de belangrijkste nadelen van deze eerder gepubliceerd diermodellen is echter dat ze niet de fysieke beperkingen die tumorgroei regelen de dura mater niet is afgedicht na de injectie van de celsuspensie 9,13,14 nabootsen. Glioomcellen kunnen lekken in deextradurale ruimte transformeren van een orthotopic glioma model in een heterotopische een.
Het diermodel hier gepresenteerde bestaat uit de injectie van een sferoïde fluorescerende glioma cellen in de cerebrale cortex op een diepte van 200 urn, gevolgd door het afdichten van de dura mater met een verknoopte dextran-gel hemi parel en histo-compatibel lijm . De tumorgroei wordt dan beperkt tot het hersenparenchym dat pathofysiologische fysieke beperkingen stelt. Een chronische lood raam boven de tumor geïmplanteerd maakt een eenvoudige optische toegang voor intravitale twee-foton microscopie. Met behulp van transgene dieren uiten fluorescerende tags in cellen van belang is het mogelijk om een follow-up van de glioma groei uit te voeren in de tijd en om de interactie te bestuderen met zijn micro-omgeving (hier met neuronen en vaatstelsel gemarkeerd met fluorescerende dextranen).
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze aanpak maakt het gebruik van optische imaging methoden om toezicht te houden over dagen en weken de groei van een orthotopically geïmplanteerd glioom. Dezelfde dier kan vervolgens vrijwel elke brain imaging modaliteit worden onderworpen tijdens de pathologie; maar de twee-foton microscopie specifieke voorbereiding biedt de unieke mogelijkheid om subcellulaire resolutie in de hersenen van de levende dieren te bereiken. Het protocol heeft als voordeel om de tumorgroei te handhaven in het cerebrale parenchym plaats b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs hartelijk danken dr. KK Fenrich, dr. MC. Amoureux, P. Weber en A. Jaouen voor nuttige discussies; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, het personeel van het dier faciliteit op IBDML en het personeel van de PicSIL imaging platform op IBDML voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Institut National du Cancer (INCA-DGOS-INSERM6038) naar GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Federation pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) naar FD, door beurzen van de Federation de la Recherche Medicale en Canceropôle PACA naar CR.
Materials
| Drill | Dremel (Germany) | 398 | any high quality surgical bone drill would suffice |
| Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr) | World Precision Instruments (USA) | 501860 (#1/4) | also sold by Harvard Apparatus |
| Tissue scissors | World Precision Instruments (USA) | 14395 | |
| Dumont tweezers M5S | World Precision Instruments (USA) | 501764 | |
| Dental cement | GACD (USA) | 12-565 & 12-568 | |
| Cyanoacrylate | Eleco-EFD (France) | Cyanolit 201 | |
| Glass capillaries without filament | Clark Electromedical Instruments (UK) | GC100-15 | |
| Microliter syringe (25 µl) | Hamilton (USA) | 702 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments (USA) | Kite-R | |
| T derivation (3-way stopcock – Luer lock) | World Precision Instruments (USA) | 14035-10 | |
| Stereotactic frame (mouse adaptor) | World Precision Instruments (USA) | 502063 | |
| Glass coverslips | Warner Instruments (USA) | CS-5R (64-0700) | |
| Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads | Available from various suppliers including Sigma (Germany) | ||
| Eye ointment | TVM (France) | Ocry-gel | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII (Germany) | also sold by other companies | |
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP (Germany) | also sold by other companies (Nikon, …) | |
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | also sold by other companies |
References
- DeAngelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).
- Ricard, D., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 379, 1984-1996 (2012).
- Prados, M. D., et al. Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).
- Piao, Y., et al. Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype. Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
- Studwell, A. J., Kotton, D. N. A shift from cell cultures to creatures: in vivo imaging of small animals in experimental regenerative medicine. Mol Ther. 19, 1933-1941 (2011).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243, 221-226 (2011).
- Ricard, C., et al. Short-term effects of synchrotron irradiation on vasculature and tissue in healthy mouse brain. J Synchrotron Radiat. 16, 477-483 (2009).
- von Baumgarten, L., et al. Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells. Clin Cancer Res. 17, 6192-6205 (2011).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , 680 (2008).
- Lathia, J. D., et al. Direct in vivo evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6, (2011).
- Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
- Winkler, F., et al. Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis. Glia. 57, 1306-1315 (2009).
- Newcomb, E., Zagzag, D., Van Meir, E. G. Ch. 12. CNS Cancer, Cancer Drug Discovery and Development. , 227-241 (2009).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
