Differentiële Labeling van Cell-oppervlak en Internalized Eiwitten na Antibody Voeden van Levende gekweekte neuronen
Summary
We beschrijven een methode om eiwit label op het oppervlak van levende neuronen met een specifiek polyklonaal antilichaam tegen extracellulaire epitopen. Eiwit door het antilichaam gebonden op het celoppervlak en vervolgens geïnternaliseerd via endocytose kunnen worden onderscheiden van eiwitten nog op of verhandeld bij het oppervlak tijdens de incubatie.
Abstract
Om het celoppervlak lokalisatie van een vermoedelijke transmembraan receptor in gekweekte neuronen demonstreren we de gemerkte eiwit op het oppervlak van levende neuronen met een specifiek primair antilichaam opgewekt tegen een extracellulair gedeelte van het eiwit. Aangezien receptoren worden verhandeld en naar de oppervlakte, wanneer cellen permeabel na fixatie dan zowel celoppervlak en interne eiwit wordt gedetecteerd door dezelfde gelabelde secundaire antilichaam. Hier passen wij een methode om eiwittransport ("antilichaam feeding") bestuderen labelen eiwit dat werd geïnternaliseerd door endocytose in de antilichaam incubatiestap en eiwitten die zijn gebleven op het celoppervlak of werd verhandeld aan het oppervlak tijdens deze periode differentieel . De mogelijkheid om deze twee zwembaden van eiwit te onderscheiden werd mogelijk gemaakt door de integratie van een overnachting blokkering stap met sterk geconcentreerde ongelabelde secundair antilichaam na een eerste broen van unpermeabilized neuronen met een fluorescent gelabelde secundaire antilichaam. Na de blokkeringsstap, permeabilisatie van de neuronen toegestane detectie van de geïnternaliseerde zwembad met een fluorescent gelabeld secundair antilichaam met een andere fluorofoor. Met deze techniek konden we belangrijke informaties subcellulaire locatie van dit vermeende receptor verkrijgen, onthullen dat het inderdaad verhandeld het celoppervlak in neuronen. Deze techniek is breed toepasbaar op verschillende celtypes en cel-oppervlakte-eiwitten, die een passend antilichaam aan een extracellulair epitoop beschikbaar.
Introduction
Bij het vaststellen van de functie van nieuw geïdentificeerde eiwitten, kan onderzoek naar de subcellulaire lokalisatie van en handel van het eiwit in kwestie belangrijke aanwijzingen over de mogelijke rol / s van het eiwit 1,2 bieden. Bioinformatica analyse van de transcriptome van de zich ontwikkelende neocortex 3 gaf ons een lijst van genen veranderde expressie vertonen in de hersenen van muizen corticogenesis. Vervolgens heeft een knockout benadering vast te stellen dat het eiwit gecodeerd door een van deze genen, sez6, heeft een belangrijke rol in neuron ontwikkeling. We zagen dat de beslaglegging gerelateerde gen 6 of Sez6, eiwit in de ontwikkeling dendrieten en is ook aanwezig in dendritische gespecialiseerde structuren dendrieten ontvangt en integreert prikkelende signalen. Bovendien, wanneer dit eiwit ontbreekt, dendrieten en exciterende synapsen niet goed 4 vormen. De waarschijnlijke overheersende isovorm van het eiwit kenmerken van een transmembrane receptor hoewel, wanneer de subcellulaire verdeling van immunologisch eiwit werd onderzocht door confocale microscopie of immuno-elektronenmicroscopie meeste, zo niet alle, van het signaal bleek geassocieerd met kleine blaasjes in het somatodendritische compartiment met weinig of geen eiwit, dat op de plasmamembraan aan het celoppervlak.
Om definitief te tonen dat dit vermeende receptor met een voorspeld extracellulair domein groot is verhandeld naar de plasmamembraan, we levende cellen benadering vastgesteld middels het antiserum we hadden gegenereerd aan een extracellulaire deel van het eiwit aan eiwit label op het celoppervlak. Door deze "antilichaam feeding" benadering twee toepassingen van differentieel-gelabelde secundaire antilichaam gescheiden door een uitgebreide blokkering stap en permeabilisatie stap konden we twee verschillende pools van eiwit onderscheidt identificeren door binding aan fluorescent gelabelde secundaire antilichamen onderdelen verschillende tlent tags. Zo konden wij eiwit dat werd geïnternaliseerd door endocytose in het antilichaam incubatiestap uit eiwitten die zijn gebleven op het celoppervlak of werd verhandeld aan het oppervlak tijdens deze periode onderscheiden. Met deze methode, hebben we vastgesteld dat het eiwit van belang wordt verhandeld en naar het celoppervlak in neuronen. Daarom deze relatief snelle en eenvoudige techniek bleek informatiever dan traditionele methoden immunocytochemie of pre-embedding immunogoud elektronenmicroscopie, hoewel we gebruikten dezelfde konijnen polyklonaal antiserum voor al deze technieken. Deze techniek is algemeen toepasbaar op elke transmembraan eiwit bood een goede antilichaam dat extracellulair domein epitopen beschikbaar. De techniek is al eerder gebruikt om receptor handel van de glutamaat receptor subeenheid GluR1 5 bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven techniek complementair is aan die van celoppervlak biotinylering (beoordeeld door Arancibia-Cárcamo et al..) 12 en is de voorkeursmethode voor het bewaren van gegevens over de subcellulaire lokalisatie van de geïnternaliseerde proteïne, mits een geschikt primair antilichaam aan een extracellulaire epitoop beschikbaar. Bovendien kan kwantificering van proteïne transport / internalisatie tijd worden uitgevoerd (door het vaststellen dekglaasjes gedurende verschillende levende cel …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Teele Palumaa voor hulp bij de cijfers. Gefinancierd door Project Grant 1008046 van de National Health and Medical Research Council, Australië.
Materials
| PBS with Ca and Mg | Invitrogen | 14040182 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich Australia | A9418 | |
| Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red | Invitrogen (Gibco) | 14175-079 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich Australia | P0899 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | Thaw on ice prior to making aliquots |
| Fetal bovine serum HyClone | Thermo Fisher | ||
| fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich Australia | F0503 | |
| uridine | Sigma Aldrich Australia | U3003 | |
| 18 mm round glass coverslips | Menzel Gläser | CB00180RA1 | |
| VECTASHIELD aqueous mounting medium | Vector Laboratories | H1400 | |
| Donkey anti-rabbit Dylight 649 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-495-152 | |
| AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-007-003 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich Australia | P6148 | TOXIC – handle in fume hood |
| Triton-X-100 | Sigma Aldrich Australia | T8787 | |
| Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody | Invitrogen – Molecular Probes | A21206 |
References
- Lewis, T. L., Mao, T., Arnold, D. B. A role for myosin VI in the localization of axonal proteins. PLoS Biol. 9, (2010).
- von Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -. S. Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression. Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).
- Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons. Neuron. 56, 621-639 (2007).
- Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines. Cell. 141, 524-535 (2010).
- Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
- Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture. Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).
- Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation. Neuron. 34, 985-998 (2002).
- Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP. Science. 305, 1972-1975 (2004).
- Kennedy, M. J. &. a. m. p. ;., Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).
- Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking. J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).
- Arancibia-Cárcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T., Kittler, J. T., Moss, S. J. Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches. The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. , (2006).
- Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation). Neuron. 63, 92-105 (2009).
- Reider, A., Wendland, B. Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane. J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).
