Um método de precipitação de modificação para isolar exossomas urinária
Summary
This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.
Abstract
Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.
Introduction
Exosomes urinário são pequenas vesículas internas de 100 nm de corpos multivesiculares (MVB) derivados de todos os tipos de células em condições normais e patológicas no espaço urinário incluindo podocytes glomerular, células tubulares renais e células que revestem os sistemas de drenagem urinária que parecem ser enriquecido para miRNAs 1 -2. Muitos investigadores detectaram proteínas distintas em exossomas isoladas a partir da urina de indivíduos saudáveis, bem como aqueles com insuficiência renal e / ou doenças sistemáticas 3-5. Os exossomas podem ser isoladas utilizando métodos diferentes, tais como de dois passos de ultracentrifugação diferencial com ou sem sacarose 6-7, combinando filtro nanomembrane com ultracentrifugação 8-9, 10-11 ou precipitação. Recentemente, desenvolveu um método simples, rápido, escalável e eficaz para isolar exossomos urinárias e detectar miRNA e biomarcadores de proteínas 11. Embora biomarcadores pode ser detectada numa variedade de diferentes fluidos biológicos, urina é a escolha mais conveniente para os doentes com doenças do rim e do tracto urinário, porque pode ser obtido em grandes quantidades de forma relativamente não invasivo.
Embora existam vários métodos para isolar exossomas urinário 6-11, o processo mais vulgarmente usado depende ultracentrifugação diferencial com uma almofada de sacarose a 30%. Enquanto este método é eficiente e a qualidade das resultantes isolados exossomas com este procedimento é alta, a técnica em si requer pessoal especializado e é, que exige vários passos de ultracentrifugação demorado. Outros métodos, tais como filtração e precipitação, têm sido desenvolvidos para o isolamento de exossomas, incluindo um que utiliza um reagente de precipitação proprietário (ou seja, ExoQuick-TC: Biosciences sistema; Mountain View, CA). Embora a precipitação utilizando este reagente é rápido e relativamente fácil, a pureza dos isolados exossomas é baixa em comparação com o met ultracentrifugaçãood. Recentemente, em comparação seis métodos para o isolamento de exossomas urinário, incluindo uma modificação do método de precipitação utilizando ExoQuick-TC que nós desenvolvemos no nosso laboratório 11. Descobrimos que este método de precipitação modificada produziu maiores quantidades de proteína, miRNA e mRNAs e o procedimento em si foi mais rápido e mais fácil de implementar do que ultracentrifugação. Aqui, nós descrevemos o protocolo experimental do nosso método de precipitação modificado de forma gradual, e incluem uma discussão sobre as vantagens e desvantagens da técnica em comparação com outros métodos de isolamento de exossomas. O método envolve uma precipitação modificado precipitação inicial de partículas de exossoma, seguido de remoção de proteína Tamm-Horsfall, que está correlacionada com proteínas exosomal, e conhecido por reduzir a produção de urina a partir de exossoma. Descobrimos que essas modificações aumentaram o rendimento e a pureza da preparação exosomal a partir de urina.
Protocol
Representative Results
Discussion
A maioria dos métodos que envolvem a precipitação de exossomas a partir de urina não abordam a remoção da rede polimérica formada pela proteína Tamm-Horsfall (THP). Esta proteína está presente em grandes quantidades na urina, onde entra em armadilhas putativamente exossomas inicial durante a centrifugação a baixa velocidade. Em nosso método modificado reduzimos THP usando DTT antes da precipitação exosome. Como mostrado na Figura 2, uma quantidade mais elevada de THP foi observado na urin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Roney Family Foundation for the support of this study. We acknowledge the contribution of Dr. M. Lucrecia Alvarez to the planning and execution of the experiments described in this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Corning 15ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12 % Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
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