Les méthodes de détection quantitative d'anticorps induite par l'activation du complément sur les globules rouges
Summary
Nous décrivons ici deux dosages pour mesurer l'activation du complément induite par des anticorps contre les globules rouges. L'avantage majeur sur les tests actuels est leur nature quantitative et facile à interpréter.
Abstract
Les anticorps contre les globules rouges (hématies) peuvent conduire à l'activation du complément entraîne une clairance accélérée via les récepteurs du complément dans le foie (hémolyse extravasculaire) ou conduisant à la lyse des globules rouges intravasculaire. Allo-anticorps (par exemple ABO) ou auto-anticorps contre les antigènes RBC (comme on le voit dans l'anémie hémolytique auto-immune, AIHA) conduisant à l'activation du complément sont potentiellement dangereux et peuvent être – surtout quand conduisant à la lyse intravasculaire – fatale 1. Actuellement, l'activation du complément en raison de (auto)-anticorps sur les globules rouges est évaluée in vitro en utilisant le test de Coombs reflétant dépôt du complément sur RBC ou par un dosage hémolytique non quantitative reflétant lyse RBC 1-4. Cependant, pour évaluer l'efficacité des inhibiteurs du complément, il est obligatoire de disposer de techniques quantitatives. Nous décrivons ici deux de ces techniques. Tout d'abord, un dosage pour détecter C3 et C4 sur le dépôt de globules rouges qui est induite par des anticorps dans le sérum du patient est préprésentés. Pour cela, on utilise une analyse par FACS avec anticorps anti-C3 ou C4 anti-marquées par fluorescence. Ensuite, une analyse quantitative hémolytique est décrite. Dans ce dosage, l'hémolyse, médiée par le complément induite par le sérum du patient est mesurée usage de la fabrication de détection spectrophotométrique de l'hémoglobine libérée. Ces deux essais sont très reproductible et quantitative, ce qui facilite les études de l'activation du complément induite par des anticorps.
Introduction
Les anticorps contre les globules rouges (hématies) peut être induite par la transfusion de globules rouges exprimant un antigène qui n'est pas présent sur les globules rouges de destinataire. Ces allo-anticorps peuvent provoquer de graves réactions transfusionnelles hémolytiques aiguës dues à l'activation du complément sur la transfusion 5 suivant. En cas d'anémie hémolytique auto-immune (AHAI), les patients ont des auto-anticorps contre leurs propres globules rouges. Cela conduit à la clairance accélérée des cellules via l'interaction de l'IgG lié à hématies avec les récepteurs Fcy sur des phagocytes dans la rate et / ou dans les cas d'auto-anticorps capables d'activer le complément par l'intermédiaire de récepteurs du complément dans le foie 6,7. L'activation du complément fulminante résultant de l'hémolyse intravasculaire est rare mais souvent fatale. Accélérée, compléter la destruction des hématies médiation induite soit par des résultats d'allo-ou auto-anticorps dans l'anémie aiguë et une hypoxie tissulaire donc potentiellement mortelle. Les auto-anticorps dans AHAI sont classés dans les anticorps chauds et froids, depending à la température optimale, ils se lient à des globules rouges (37 ° C ou plus bas, respectivement). Les anticorps chauds sont généralement de l'isotype IgG et les anticorps IgM froides de l'isotype 8,9. AIHA peut être secondaire à des troubles lymphoprolyferative par exemple, des maladies des tissus conjonctifs, les tumeurs solides, des infections ou des médicaments, mais dans 50% des cas AIHA 9 est idiopathique.
Détection des gammaglobulines (p. ex. IgG ou IgM) et compléter lié à globules rouges du patient est réalisée au moyen d'un Coombs direct semi-quantitative (Coombs) d'essai (DAT). Dans la DAT globules rouges de patients sont incubés avec des anticorps anti-IgG ou anti-C3d. Présence de RBC agglutination démontre la présence de composants du complément attachés ou liaison de l'IgG. Détection des allo-ou auto-anticorps dans le sérum du patient est réalisée par l'intermédiaire du test de Coombs indirect (IAT). Dans l'IAT, les globules rouges de test bromélaïne traitées sont incubées avec le sérum du patient, lavées puis incubées avec des anticorps anti-human IgG. Dans le cas où les globules rouges ont été sensibilisées avec un anticorps anti-IgG RBC présent dans le sérum du patient d'agglutination va se produire. IgM anti-globules rouges mènera directement à l'agglutination des globules rouges lors de l'incubation de test bromélaïne traités avec le sérum du patient. RBC agglutination dans le test de Coombs direct ou dans le TAI est évaluée visuellement, soit à l'oeil dans un tube à essai ou en chargeant l'échantillon sur une petite colonne de Sephadex séparer les globules rouges agglutinés et simples selon la taille 1.
Une autre technique fréquemment utilisée pour mesurer l'activation du complément sur les globules rouges est le dosage hémolytique 1, dans lequel la capacité du sérum du patient pour induire (médiée par le complément) hémolyse des hématies de bromélaïne traité 10 est évaluée. Le test est noté comme positif lorsque le surnageant après centrifugation est coloré en rouge en raison de l'hémoglobine libérée et considéré comme négatif si elle reste incolore. Tant le test de Coombs et le dosage hémolytique sont semi-quantitative, depuis la plus haute serum dilution est notée dans lequel le test est toujours positif.
Le test de Coombs et le dosage hémolytique sont des tests robustes qui sont couramment utilisés dans le diagnostic. Étant donné que ces tests sont semi-quantitative et en fonction de l'expérience du technicien effectuant le test, ils ne sont pas adaptés à l'étude des différences subtiles de l'activation du complément sur les globules rouges, en fonction des besoins lors de l'évaluation de l'efficacité des inhibiteurs du complément. Par conséquent, nous avons développé deux essais quantitatifs pour déterminer l'activation du complément par (auto)-anticorps de globules rouges, que nous décrirons dans le présent document.
Tout d'abord, nous avons développé un dosage pour mesurer le dépôt de fragments d'activation du complément C3 et C4 sur les globules rouges (figure 1A). Dans cet essai, la bromélaïne traitée humains de type 0 globules rouges sont mis à incuber avec du sérum inactivé à la chaleur du patient (source d'anticorps anti-RBC), de sérum AB frais (source de complément) et anti-C5 anticorps monoclonal (eculizumab). Au cours de cette incubation, C3 et C4 dépôt se produit si le sérum du patient contient de compléter l'activation des anticorps anti-RBC. Afin d'empêcher la lyse RBC par l'activation du complément en aval d'un anticorps monoclonal anti-C5 est ajouté blocage. Ensuite, C3 et C4 sur le dépôt des hématies est détecté par FACS en utilisant des anticorps monoclonaux marqués par fluorescence ou des fragments Fab réagissant avec C3 et C4, respectivement. Déclenchement sur simple globules rouges est important de s'assurer de la fiabilité des résultats. Les avantages de cette technique sont que d'un petit volume de matière du patient est nécessaire, l'activation du complément à un stade précoce de la cascade est évaluée et le procédé est reproductible et quantitative. Un avantage supplémentaire de la recherche à la fois à C3 et C4 est de faire une distinction peut être faite entre l'activation et la lectine voie classique (à la fois C3 et C4 dépôt) et l'activation de la voie alterne (seulement de dépôt C3). L'utilisation d'hématies de bromélaïne traitée au lieu de globules rouges non traités augmente la sensibilité de l'endire.
Le second test est basé sur le dosage hémolytique actuellement utilisée (Figure 1B). Bromélaïne traitée humaines de type 0 globules rouges sont mis à incuber avec du sérum inactivé à la chaleur du patient (source d'anticorps anti-RBC) et du sérum AB frais (source de complément). Si le complément est activé par des anticorps anti-RBC patients, dose-dépendante lyse RBC aura lieu, entraînant la libération de l'hémoglobine. La quantité d'hémoglobine libérée est quantifiée en mesurant son absorbance à 414 nm dans le surnageant après filage en bas des globules rouges intacts et fragmentés. L'absorbance est en corrélation avec la quantité d'hémolyse produite. Contrairement au dosage utilisé actuellement, ce protocole permet à un objectif, la valeur quantitative de l'hémolyse qui est très reproductible et ne dépend pas de la personne qui interprète le dosage.
Une application de ces méthodes a été décrite en 11, où l'utilisation potentielle de C1-inhibiteur comme inhibiteur du complément dans l'AIHA a studied.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les dosages ci-dessus sont reproductibles et robuste. Ils sont faciles à réaliser et il est possible de les réaliser avec de nombreux échantillons à la fois (dans une plaque à 96 puits). Par conséquent, cette approche serait également approprié pour un système entièrement automatisé, par exemple un système de robot ELISA. Par contraste avec les techniques actuellement utilisées, ces dosages sont quantitatifs et cela aide par exemple dans l'étude de l'effet des inhibiteurs du comp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SZ et DW reçoivent une subvention sans restriction de Viropharma.
Materials
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| bromelain | Sanquin | K1121 |
References
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