Análise da Tradução Iniciação Durante condições de estresse por polysome Profiling
Summary
Aqui, descrevemos um método para analisar mudanças na iniciação da tradução do mRNA de células eucarióticas em resposta a condições de estresse. Este método baseia-se na separação de velocidade em gradientes de sacarose de traduzindo ribossomas de ribossomas não traduzindo.
Abstract
O controle preciso da tradução do mRNA é fundamental para a homeostase da célula eucariótica, em particular na resposta ao stress fisiológico e patológico. Alterações deste programa pode conduzir ao crescimento de células danificadas, uma indicação de desenvolvimento de cancro, ou a morte prematura das células, tal como visto nas doenças neurodegenerativas. Muito do que se conhece sobre a base molecular para o controlo da tradução foi obtido a partir de análise de polissoma usando um sistema de fraccionamento de gradiente de densidade. Esta técnica baseia-se na ultracentrifugação de extractos citoplasmáticos de um gradiente linear de sacarose. Uma vez que a rotação é completado, o sistema permite o fraccionamento e quantificação de zonas correspondentes a centrifugadas traduzindo diferente ribossomos populações, resultando, assim, em um perfil de polissoma. As alterações no perfil de polissoma são indicativos de alterações ou defeitos de iniciação da tradução que ocorrem em resposta a vários tipos de stress. Esta técnica também permite avaliar the papel de proteínas específicas no início da tradução e, para medir a atividade de translação de mRNAs específicos. Aqui descrevemos o nosso protocolo para realizar perfis de polissomas, a fim de avaliar a iniciação da tradução de células e de tecidos eucarióticos, em condições de crescimento normais ou de stress.
Introduction
As células eucarióticas encontrar constantemente uma gama de condições de estresse fisiológicos e ambientais nocivos que exigem uma resposta celular adaptativa rápida. Resposta ao estresse celular envolve um equilíbrio preciso entre anti-sobrevivência e pró-sobrevivência fatores atuando. Perturbar este equilíbrio pode ter consequências irreversíveis que levam ao desenvolvimento de patologias humanas, como câncer e doenças neurodegenerativas. Durante o primeiro passo da resposta ao stress, as células de activar as vias pró-sobrevivência que envolvem o controlo coordenado de alterações na expressão do gene ao nível da tradução do mRNA.
tradução do mRNA em eucariotos é um processo celular complexo que envolve interações coordenadas entre os fatores de iniciação da tradução (EIFS), proteínas de ligação de RNA específico (RBDs) e moléculas de RNA 1. tradução do mRNA é dividido em três fases distintas: iniciação, alongamento e terminação. Embora todas as três fases estão sujeitos a regulamenmecanismos reguladoras nacionais, os mecanismos de controlo da tradução como alvo principalmente na fase de iniciação da tradução, que assim constitui o passo limitante da taxa de síntese de proteína 2.
De iniciação da tradução é um processo altamente ordenadas que começa com a formação da eIF2a.GTP.Met-ARNt eu Met complexo ternário e sua subsequente ligação à subunidade 40S do ribossoma, levando à formação do complexo de pré-iniciação. O próximo passo é o recrutamento do complexo de pré-iniciação de ARNm, que envolve a actividade de factores de iniciação da tradução, tais como eIF4F e eIF3. O complexo de pré-iniciação 48S assim formado sofre alterações conformacionais específicos que permitem que esta maquinaria para iniciar a digitalização da região 5 'não traduzida do mRNA, até que reconhece o codão de iniciação agosto A maioria dos fatores de iniciação da tradução são então liberados e 60 subunidades são recrutados para formar um ribossomo 80S complexo competente para a tradução, umat que começa síntese protéica ponto (Figura 1). Mais do que uma 80S monosome pode ser traduzindo o mesmo mRNA de cada vez produzindo assim chamados polissomas (ou polirribossomas). A densidade de polissomas num ARNm reflecte a iniciação, elongação e taxas de terminação e, assim, é uma medida da traductibilidade de um transcrito particular. No entanto, em polissoma perfil é utilizado principalmente para avaliar alterações na tradução do mRNA na etapa de iniciação. Aqui utilizámos um inibidor de proteassoma, como inibidor de iniciação da tradução. O tratamento de células cancerosas com esta droga induz uma resposta ao estresse caracteriza-se pela ativação do estresse chamado HRI quinase que fosforila o fator de iniciação da tradução eIF2a 3. A fosforilação de eIF2a é um dos principais eventos que levam à inibição da iniciação da tradução, em células de mamíferos 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
A análise do perfil de polissoma em gradientes de sacarose permite a medição da iniciação da tradução através da análise da densidade de polissomas isolados a partir de células ou tecidos de 9,11-14. Esta técnica é a melhor (se não o único) abordagem para medir a iniciação da tradução in vivo. Ele é utilizado para monitorizar o estado de crescimento de células de translação durante o ciclo de célula 15, e para avaliar os efeitos de vários tipos de stress, incluindo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PA é um beneficiário de uma bolsa "Pierre Durand" pela Faculdade de Medicina da Universidade de Laval. Este trabalho foi apoiado pelas Ciências Naturais e Engenharia Research Council of Canada (MOP-CG095386) para RM O fraccionamento polysome foi adquirida através de uma Fundação Canadense para concessão inovação (MOP-GF091050) para RMR M tem um novo prêmio salário investigador CIHR.
Somos gratos aos drs. E. Khandjian, I. Gallouzi, S. Di-Marco e A. Cammas para conselhos úteis.
Materials
| Cells | ||||
| HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | ||
| Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | ||
| Culture medium and Supplements | ||||
| Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | ||
| DMEM | Life technologies | 11995-073 | ||
| FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | ||
| penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | ||
| Sucrose solutions | ||||
| D-Sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | ||
| Blue Bromophenol | Fisher Scientist | B3925 | ||
| Lysis buffer | ||||
| Tris Hydrochloride | Fisher Scientist | BP153-500 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | ||
| NaCl | Tekniscience | 3624-05 | ||
| DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | ||
| Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | ||
| SDS | Tekniscience | 4095-02 | ||
| RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | ||
| Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | ||
| RNA Extraction | ||||
| Proteinase K | Life technologies | AM2542 | ||
| Phenol: Chloroforme | Fisher Scientist | BP1754I-400 | ||
| Chloroforme | Fisher Scientist | C298-500 | ||
| Glycogen | Life technologies | 10814-010 | ||
| Isopropanol | Acros organics | 327270010 | ||
| Antibodies | ||||
| anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | |||
| anti-Ribosomal Protein L28 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-50362 | ||
| Others | ||||
| Proteasome inhibitor : Bortezomib | LC Laboratories | B-1408 | ||
| DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D5758-25ml | ||
| RNaseZAP Solution | Life technologies | AM9780 | ||
| Materials | ||||
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | ||
| 1cc U100 Insulin Syringe 28 G1/2 | Fisher Scientist | 148291B | ||
| Tube ultra-centrifugation, PA, 12ml | Fisher Scientist | FSSP9763205 | ||
| Isco Model 160 gradient former | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| Ultracentrifuge Sorvall OTD Combi | ||||
| Thermo Scientific Sorvall Rotor TH-641 | Thermo scientific | 54295 | ||
| Automated Density Fractionation System | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | 67-9000-177 | ||
| Isco UA-6 UV-vis detector | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | |||
| Ultracentrifuge C 5415 | Eppendorf | |||
| Optical Microscope | Olympus CK2 | |||
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