Analyse av Oversettelse Innvielse Under stressbetingelser ved Polysome Profilering
Summary
Her beskriver vi en fremgangsmåte for å analysere endringer i initiering av mRNA oversettelse av eukaryote celler som svar på stressbetingelser. Denne metoden er basert på hastighetsseparasjon på sakkarosegradienter av sette ribosomer fra ikke-sette ribosomer.
Abstract
Nøyaktig kontroll av mRNA oversettelse er fundamental for eukaryot celle homeostase, særlig som følge av fysiologisk og patologisk stress. Endringer av dette programmet kan føre til vekst av skadede celler, et kjennetegn på kreftutvikling, eller til for tidlig celledød, for eksempel som vist i neurodegenerative sykdommer. Mye av det som er kjent angående den molekylære basis for translasjons-kontroll er blitt oppnådd fra polysome analyse ved hjelp av en densitetsgradient fraksjoneringssystem. Denne teknikken bygger på ultracentrifugation av cytoplasmatiske ekstrakter på en lineær sukrosegradient. Når spinningen er fullført, kan systemet fraksjonering og kvantifisering av sentrifugert soner svarende til forskjellige populasjoner sette ribosomer, noe som resulterer i en polysome profil. Endringer i polysome profilen er en indikasjon på endringer eller mangler ved translasjons-initierings som forekommer som respons på forskjellige typer stress. Denne teknikken gjør det også mulig å vurdere the rollen til spesifikke proteiner for translasjonsinitiering, og for å måle translatorisk aktiviteten av spesifikke mRNA. Her beskriver vi vår protokoll for å utføre polysome profiler for å vurdere oversettelse initiering av eukaryote celler og vev enten under normale eller stress vekstvilkår.
Introduction
Eukaryote celler stadig støter på en rekke skadelige fysiologiske og miljømessige stress forhold som krever rask adaptiv celle respons. Cell stressrespons innebærer en presis balanse mellom anti-overlevelse og pro-overlevelse virkende faktorer. Forstyrre denne balansen kan ha irreversible konsekvenser som fører til utvikling av menneskelige sykdommer som kreft og nevrodegenerative sykdommer. Under det første trinn av stressrespons, celler aktiverer pro-overlevelsesveier som involverer den koordinerte styring av endringer i genekspresjon på nivået av mRNA oversettelse.
mRNA oversettelse i eukaryoter er en kompleks cellulær prosess som innebærer koordinert samhandling mellom oversettelse initiering faktorer (EIFS), spesifikt RNA bindende proteiner (RBDs), og RNA-molekyler en. mRNA oversettelse er delt inn i tre distinkte faser: initiering, forlengelse, og terminering. Selv om alle tre fasene er underlagt regulatory mekanismer, translasjonelle kontrollmekanismer retter seg for det meste initieringsfasen av translasjon, som således utgjør det hastighetsbegrensende trinn i proteinsyntesen 2.
Oversettelse initiering er en høyt organisert prosess som begynner med dannelsen av eIF2a.GTP.Met-tRNA i Met ternært kompleks og etterfølgende binding til det 40S ribosom-underenheten, som fører til dannelsen av for tidlig detonasjon kompleks. Det neste trinnet er rekrutteringen av preinitiation komplekset til mRNA, noe som innebærer at aktiviteten av translasjon initiering av faktorer som eIF4F og eIF3. Den 48S preinitiation kompleks dermed dannet gjennomgår bestemte konformasjonsendringer som gjør dette maskineriet skal begynne å skanne 5'-untranslated region av mRNA før den gjenkjenner startkodonet august De fleste av oversettelses initiering faktorene blir deretter løslatt og 60S subenheter er rekruttert for å danne en 80S ribosom kompleks kompetent for oversettelse, ent hvilket punkt proteinsyntese begynner (fig. 1). Mer enn en 80S monosome kan oversette det samme mRNA gangen produsere såkalte polysomes (eller polyribosomes). Tettheten av polysomes på en mRNA reflekterer initiering, tøyelighet og terminerings prisene og dermed er et mål på translatability av et bestemt transkript. Imidlertid er polysome profilen hovedsakelig brukt for å vurdere endringer i mRNA oversettelse ved initiering trinn. Her har vi brukt en proteasominhibitor som oversettelse initiering inhibitor. Behandling av kreftceller med dette stoffet induserer en stressrespons, karakterisert ved aktivering av stress kinase heter HRI som fosforylerer translasjons-initierings-faktor eIF2a 3. Fosforylering av eIF2a er en av de viktigste hendelser som fører til hemming av translasjon initiering i pattedyrceller 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den polysome profilanalyse på sakkarosegradienter tillater måling av oversettelse initiering ved å analysere tettheten av polysomes isolert fra celler eller vev 9,11-14. Denne teknikk er best (hvis ikke den unike) tilnærming til måling av translasjons-initierings in vivo. Den brukes til å overvåke statusen for translatorisk voksende celler i løpet av cellesyklusen 15, og for å vurdere virkningene av forskjellige typer stress, inkludert virusinfeksjoner, hypoksi 13,16, s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PA er en mottaker av et stipend "Pierre Durand" fra Fakultet for medisin av Laval University. Dette arbeidet ble støttet av naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (MOP-CG095386) til RM The polysome fraksjone ble kjøpt gjennom en kanadisk Foundation for innovasjon stipend (MOP-GF091050) til RMR M har en ny CIHR etterforsker lønn award.
Vi er takknemlige for legene. E. Khandjian, I. Gallouzi, S. Di-Marco og A. Cammas for nyttige råd.
Materials
| Cells | ||||
| HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | ||
| Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | ||
| Culture medium and Supplements | ||||
| Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | ||
| DMEM | Life technologies | 11995-073 | ||
| FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | ||
| penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | ||
| Sucrose solutions | ||||
| D-Sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | ||
| Blue Bromophenol | Fisher Scientist | B3925 | ||
| Lysis buffer | ||||
| Tris Hydrochloride | Fisher Scientist | BP153-500 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | ||
| NaCl | Tekniscience | 3624-05 | ||
| DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | ||
| Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | ||
| SDS | Tekniscience | 4095-02 | ||
| RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | ||
| Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | ||
| RNA Extraction | ||||
| Proteinase K | Life technologies | AM2542 | ||
| Phenol: Chloroforme | Fisher Scientist | BP1754I-400 | ||
| Chloroforme | Fisher Scientist | C298-500 | ||
| Glycogen | Life technologies | 10814-010 | ||
| Isopropanol | Acros organics | 327270010 | ||
| Antibodies | ||||
| anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | |||
| anti-Ribosomal Protein L28 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-50362 | ||
| Others | ||||
| Proteasome inhibitor : Bortezomib | LC Laboratories | B-1408 | ||
| DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D5758-25ml | ||
| RNaseZAP Solution | Life technologies | AM9780 | ||
| Materials | ||||
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | ||
| 1cc U100 Insulin Syringe 28 G1/2 | Fisher Scientist | 148291B | ||
| Tube ultra-centrifugation, PA, 12ml | Fisher Scientist | FSSP9763205 | ||
| Isco Model 160 gradient former | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| Ultracentrifuge Sorvall OTD Combi | ||||
| Thermo Scientific Sorvall Rotor TH-641 | Thermo scientific | 54295 | ||
| Automated Density Fractionation System | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | 67-9000-177 | ||
| Isco UA-6 UV-vis detector | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | |||
| Ultracentrifuge C 5415 | Eppendorf | |||
| Optical Microscope | Olympus CK2 | |||
References
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).
- Fournier, M. -. J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell International. 10 (12), (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).
- Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
- Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs. Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).
- Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms. RNA. 15 (10), 1814-1821 (2009).
- Gareau, C., Houssin, E., et al. Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
- Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
- Khandjian, E. W., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).
- Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. Translational control of gene expression in the human brain. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).
- Stephens, S. B., Nicchitta, C. V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum. Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).
- Koritzinsky, M., Wouters, B. G. Hypoxia and regulation of messenger RNA translation. Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).
- Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes. Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).
- Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division. Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).
- Thomas, J. D., Johannes, G. J. Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia. RNA. 13, 1116-1131 (2007).
- Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components. 암 연구학. 68 (10), 3819-3826 (2008).
- Fournier, M. -. J., Coudert, L., et al. Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).
- Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator. Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).
- Béchade, C., Rostaing, P., et al. Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport. The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).
- Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules. Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).
- Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).
- Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association. BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).
- Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
- Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Morris, D. R. Ribosomal footprints on a transcriptome landscape. Genome Biology. 10 (4), (2009).
