Analys av Translation Initiation Under Stress villkor genom polysom Profilering
Summary
Här beskriver vi en metod för att analysera förändringar i initieringen av mRNA-translation av eukaryota celler som svar på stress förhållanden. Denna metod är baserad på den hastighet separation på sackarosgradienter av översätta ribosomer från icke-översätta ribosomer.
Abstract
Exakt reglering av mRNA-translation är grundläggande för eukaryot cell homeostas, särskilt som svar på fysiologisk och patologisk stress. Förändringar av detta program kan leda till tillväxt av skadade celler, ett kännetecken för cancerutveckling, eller till för tidig celldöd såsom framgår av neurodegenerativa sjukdomar. Mycket av vad som är känt om den molekylära grunden för translationell kontroll erhölls från polysom analys med hjälp av en densitetsgradient fraktioneringssystemet. Denna teknik bygger på ultracentrifugering av cytoplasmaextrakt på en linjär sackarosgradient. När spinn är klar, tillåter systemet fraktionering och kvantifiering av centrifugezoner som motsvarar olika översätta ribosomer populationer, vilket således resulterar i en polysom profil. Förändringar i polysom profilen indikerar förändringar eller defekter i translationsinitiering som inträffar som svar på olika typer av stress. Denna teknik gör det också möjligt att bedöma: ee rollen av specifika proteiner på translationsinitiering, och för att mäta translationell aktivitet av specifika mRNA. Här beskriver vi våra protokoll för att utföra polysom profiler för att bedöma translationsinitiering av eukaryota celler och vävnader i enlighet med antingen normala eller spänningstillväxtförhållanden.
Introduction
Eukaryota celler möter ständigt en rad skadliga fysiologiska och miljömässiga stressförhållanden som kräver en snabb adaptiv cellsvar. Cell stress innebär en exakt balans mellan anti-överlevnad och pro-överlevnad verkande faktorer. Störa denna balans kan få oåterkalleliga konsekvenser som leder utvecklingen av mänskliga sjukdomar som cancer och neurodegenerativa sjukdomar. Under det första steget av stress, celler aktiverar pro-överlevnad vägar som innebär samordnad kontroll av förändringar i genuttryck i nivå med mRNA-translation.
mRNA-translation i eukaryoter är en komplex cellulär process som involverar samordnade interaktioner mellan översättnings initieringsfaktorer (EIFS), specifika RNA-bindande proteiner (RBDS) och RNA-molekyler 1. mRNA translation är indelad i tre olika faser: initiering, töjning, och uppsägning. Även om alla tre faser är föremål för reglesyns mekanismer, translationella kontrollmekanismer riktar främst inledande fasen av översättning, som alltså utgör den hastighetsbegränsande steget av proteinsyntesen 2.
Translation initiation är en höggradigt ordnad process som börjar med bildandet av den eIF2a.GTP.Met-tRNA-I Met temära komplexet och dess efterföljande bindning till 40S-ribosom-subenheten, vilket leder till bildandet av pre-initiering komplex. Nästa steg är att rekryteringen av preinitiation komplexet till mRNA, som innebär att aktiviteten av translationsinitierings faktorer såsom eIF4F och eIF3. Den 48S preinitiation komplexa sätt bildade genomgår specifika konformationsförändringar som gör att denna maskin för att börja skanna 5'-oöversatta regionen av mRNA tills den känner igen initieringskodonet augusti De flesta av de översättnings initieringsfaktorer frigörs sedan och 60S-subenheter rekryteras för att bilda en 80S ribosomkomplexet kompetent för översättning, ent vilken punkt proteinsyntesen startar (figur 1). Mer än en 80S monosome kan översätta samma mRNA vid en tidpunkt som producerar så kallade polysomer (eller polyribosomer). Tätheten av polysomer på en mRNA speglar initiering, töjning och terminering, och därmed är ett mått på översättbarhet av en viss utskrift. Dock är polysom profil främst för att bedöma förändringar i mRNA translation vid initiering steget. Här har vi använt en proteasomhämmaren som translationsinitiering hämmare. Behandling av cancerceller med detta läkemedel inducerar en stressreaktion som kännetecknas av aktivering av stresskinas namnges HRI som fosforylerar translationsinitiering faktor eIF2a 3. Fosforylering av eIF2a är en av de viktigaste händelserna som leder till hämningen av translationsinitiering i däggdjursceller 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den polysom profilanalys på sackarosgradienter möjliggör mätning av translationsinitiering genom att analysera tätheten av polysomer isolerade från celler eller vävnader 9,11-14. Denna teknik är det bästa (om inte det unika) metod för att mäta translationsinitiering in vivo. Det används för att övervaka translationell status odla celler under cellcykeln 15, och för att bedöma effekterna av olika typer av stress, inklusive virusinfektioner, hypoxi 13,16, str…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PA är en mottagare av ett stipendium "Pierre Durand" från Medicinska fakulteten i Laval University. Detta arbete stöddes av naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (MOP-CG095386) till RM Den polysom fraktioneringsförvärvades genom en kanadensisk stiftelse för bidrags innovation (MOP-GF091050) till RMR M har en ny CIHR utredare lön utmärkelse.
Vi är tacksamma till Dr. E. Khandjian, I. Gallouzi, S. Di-Marco och A. Cammas för goda råd.
Materials
| Cells | ||||
| HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | ||
| Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | ||
| Culture medium and Supplements | ||||
| Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | ||
| DMEM | Life technologies | 11995-073 | ||
| FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | ||
| penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | ||
| Sucrose solutions | ||||
| D-Sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | ||
| Blue Bromophenol | Fisher Scientist | B3925 | ||
| Lysis buffer | ||||
| Tris Hydrochloride | Fisher Scientist | BP153-500 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | ||
| NaCl | Tekniscience | 3624-05 | ||
| DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | ||
| Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | ||
| SDS | Tekniscience | 4095-02 | ||
| RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | ||
| Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | ||
| RNA Extraction | ||||
| Proteinase K | Life technologies | AM2542 | ||
| Phenol: Chloroforme | Fisher Scientist | BP1754I-400 | ||
| Chloroforme | Fisher Scientist | C298-500 | ||
| Glycogen | Life technologies | 10814-010 | ||
| Isopropanol | Acros organics | 327270010 | ||
| Antibodies | ||||
| anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | |||
| anti-Ribosomal Protein L28 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-50362 | ||
| Others | ||||
| Proteasome inhibitor : Bortezomib | LC Laboratories | B-1408 | ||
| DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D5758-25ml | ||
| RNaseZAP Solution | Life technologies | AM9780 | ||
| Materials | ||||
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | ||
| 1cc U100 Insulin Syringe 28 G1/2 | Fisher Scientist | 148291B | ||
| Tube ultra-centrifugation, PA, 12ml | Fisher Scientist | FSSP9763205 | ||
| Isco Model 160 gradient former | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| Ultracentrifuge Sorvall OTD Combi | ||||
| Thermo Scientific Sorvall Rotor TH-641 | Thermo scientific | 54295 | ||
| Automated Density Fractionation System | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | 67-9000-177 | ||
| Isco UA-6 UV-vis detector | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | |||
| Ultracentrifuge C 5415 | Eppendorf | |||
| Optical Microscope | Olympus CK2 | |||
References
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).
- Fournier, M. -. J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell International. 10 (12), (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).
- Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
- Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs. Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).
- Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms. RNA. 15 (10), 1814-1821 (2009).
- Gareau, C., Houssin, E., et al. Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
- Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
- Khandjian, E. W., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).
- Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. Translational control of gene expression in the human brain. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).
- Stephens, S. B., Nicchitta, C. V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum. Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).
- Koritzinsky, M., Wouters, B. G. Hypoxia and regulation of messenger RNA translation. Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).
- Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes. Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).
- Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division. Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).
- Thomas, J. D., Johannes, G. J. Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia. RNA. 13, 1116-1131 (2007).
- Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components. 암 연구학. 68 (10), 3819-3826 (2008).
- Fournier, M. -. J., Coudert, L., et al. Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).
- Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator. Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).
- Béchade, C., Rostaing, P., et al. Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport. The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).
- Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules. Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).
- Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).
- Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association. BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).
- Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
- Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Morris, D. R. Ribosomal footprints on a transcriptome landscape. Genome Biology. 10 (4), (2009).
