L'isolement et la quantification de neurotoxine botulique de matrices complexes utilisant les BoTest matrice dosages
Summary
La neurotoxine botulique BoTest Matrix (BoNT) des tests de détection de purifier rapidement et quantifier BoNT d'une gamme de matrices d'échantillons. Ici, nous présentons un protocole pour la détection et la quantification de la BoNT de matrices solides et liquides et de démontrer l'essai avec BOTOX, les tomates et le lait.
Abstract
Détection précise et la quantification de la neurotoxine botulique (BoNT) dans des matrices complexes est nécessaire pour l'industrie pharmaceutique, l'environnement, et les essais de l'échantillon de la nourriture. Les tests rapides BoNT des denrées alimentaires est nécessaire pendant la criminalistique épidémiologiques, le diagnostic du patient, et des tests de sécurité alimentaire lors des tests d'activité précis est nécessaire pour la fabrication d'un produit médicamenteux à base de BoNT et la sécurité des patients. Le bio-essai souris largement utilisé pour les tests BoNT est très sensible mais manque de précision et le débit nécessaire pour les tests BoNT rapide et la routine. En outre, l'utilisation de l'essai biologique des animaux a suscité des appels par les autorités de réglementation des produits de la drogue et les partisans des droits des animaux aux États-Unis et à l'étranger pour remplacer le bio-essai sur souris pour les tests BoNT. Plusieurs essais in vitro de remplacement ont été développés qui fonctionnent bien avec purifiée BoNT dans des tampons simples, mais la plupart n'ont pas été montré pour être applicable à l'essai dans des matrices complexes. Ici, un protocole pour la détection d'BoNT dans des matrices complexes en utilisant les BoTest matrice essais est présenté. Le test se compose de trois parties: La première partie comprend la préparation des échantillons pour essais, la deuxième partie est une étape d'immunoprécipitation utilisant des anticorps anti-BoNT billes paramagnétiques recouvertes d'anticorps pour purifier BoNT de la matrice, et la troisième partie quantifie la protéolytique de l'isolement BoNT activité en utilisant un journaliste fluorogène. Le protocole est écrite pour le test à haut débit dans des plaques à 96 puits en utilisant des matrices à la fois liquides et solides et nécessite environ 2 heures de préparation manuelle avec le total des temps de dosage de 4-26 heures, selon le type d'échantillon, la charge de la toxine, et la sensibilité souhaitée. Les données sont présentées pour BoNT / A l'essai avec tampon phosphate salin, un médicament, un surnageant de culture, lait 2%, et les tomates fraîches et comprend la discussion des paramètres essentiels à la réussite du test.
Introduction
neurotoxines botuliques (de Bont) sont les substances les plus mortelles connues, avec des doses létales humaines intraveineuses estimés à 1-3 ng / kg 1,2. Sept sérotypes de BoNT structurellement similaires, marqués de A à G, exister, chacun consistant en un domaine de chaîne lourde responsable de la liaison cellulaire, l'absorption et la translocation dans le cytosol et d'une chaîne légère qui code pour une endopeptidase de zinc 5.3. La toxicité exquis de BoNT résulte, en partie, son entrée obligatoire et spécifique dans les neurones moteurs à la jonction neuromusculaire 6. Une fois à l'intérieur du neurone, l'endopeptidase de la chaîne légère clive spécifiquement une ou plusieurs de la N-éthylmaléimide sensible récepteur soluble de la protéine de fixation du facteur (SNARE) des protéines nécessaires à la fusion des vésicules, l'inhibition de la libération de neurotransmetteurs et conduisant à la paralysie flasque 7-14. Communément appelée la maladie "botulisme" paralysie du diaphragme et des muscles intercostaux par BoNT aboutit finalement dansinsuffisance respiratoire et la mort moins le diagnostic précoce et le traitement sont reçus.
Origine alimentaire humaine botulisme est le plus souvent associée à BoNT sérotypes A, B, E, et F (BoNT / A, BoNT / B, etc) et se traduit généralement par l'ingestion d'aliments contaminés 15,16; bien que, plusieurs cas de botulisme par blessure ont été signalés chez les usagers de drogues par voie intraveineuse 17,18. Aux États-Unis, le botulisme infantile résultant de l'ingestion de spores de Clostridium par les enfants de moins de un est la forme la plus commune de botulisme 19-21. Cependant, les épidémies d'origine alimentaire de neurotoxines botuliques résultant de la mise en conserve domestique inadéquate et la transformation des aliments ont été signalés dans les États-Unis et à l'étranger. Entre 2000-2009, au moins 338 cas de botulisme d'origine alimentaire ont été signalés dans le monde entier, y compris six décès 22. La capacité de détecter rapidement et de manière sensible des éclosions de botulisme d'origine alimentaire est une indication critique qui pourrait faciliter le diagnostic précoce 23,24. En outre, les méthodes de détection qui permettent rentable et les tests de routine alimentaire permettront d'améliorer la sécurité alimentaire.
Spécificité neuronale de BoNT et longue demi-vie biologique rend également une thérapeutique efficace. Aux États-Unis, les médicaments à base de BoNT sont approuvés par la Food and Drug Administration pour le traitement de conditions cosmétiques et de troubles liés neuromusculaires, y compris les rides glabellaires, la dystonie cervicale, des migraines, de la vessie hyperactive, et le strabisme. De nombreuses applications "off-label" sont documentées, y compris les traitements à forte dose pour grave dysfonctionnement musculaire 25-28. Précise toxine quantification est essentiel pour un dosage correct, comme un sous-dosage peut conduire à un traitement inefficace tout surdosage met les patients à risque d'effets secondaires potentiellement dangereux. Malheureusement, aucun protocole de test de puissance normalisée est partagée entre les fabricants, ce qui entraîne des inégalités de définition de l'unité entre les producteurs de médicaments à base de BoNTcts 29-31.
Le test standard pour BoNT est le bio-essai souris dans lesquelles des échantillons contenant BoNT sont injectés par voie intrapéritonéale à des souris et le nombre de décès enregistrés plus de 1-7 jours 16,32,33. Le bio-essai sur souris est très sensible aux limites de détection (LOD) de 5-10 pg BoNT / A 34, mais les préoccupations éthiques sur l'utilisation des animaux, le coût élevé de la formation du personnel et l'entretien des installations d'animaux, les temps de dosage longues, et le manque de protocoles normalisés ont donné lieu à des appels à se développer, les tests BoNT standardisé sans animaux et méthodes de quantification 35-39. Récemment, plusieurs méthodes de quantification de neurotoxines botuliques alternatifs ont été développés qui offrent la souris ou à proximité de la souris essai biologique sensibilité 40-49. Ces méthodes utilisent couramment fluorescence, spectrométrie de masse, ou des méthodes immunologiques et offrent des temps d'analyse considérablement plus courte que le bio-essai sur souris sans l'utilisation d'animaux. Spectrométrie de masse approches combinées avec techniq immunologiqueues ont été présentés pour détecter et quantifier BoNT contenue dans les aliments et autres échantillons complexes; toutefois, les exigences de formation du personnel et la limite de l'équipement spécialisé ces dosages 50-55. La plupart des autres tests alternatifs ne sont pas facilement applicable à des tests d'échantillonnage complexe ou n'ont pas le débit requis pour les tests de routine BoNT. La nature très variable de la viscosité de l'échantillon alimentaire, le pH, la teneur en sel, et constituants de la matrice présente un défi particulièrement difficile lorsque vous essayez de développer des méthodes d'essai in vitro avec une sensibilité pour correspondre à la puissance extrême de BoNT. De plus, même les systèmes tampons simples et relativement bénignes, telles que celles résultant de la remise en suspension de produits médicamenteux à base de BoNT, contiennent des sels, l'albumine, le sucre et les stabilisants (par exemple excipients) qui ont une incidence significative in vitro BoNT puissance 56. purification de la toxine est nécessaire pour le contrôle de l'activité précise de tous, mais le plus simple des échantillons 56-59.
LaBoTest essais de Matrix ont été conçus pour rapide, à haut débit, et la quantification de la BoNT cohérente à partir d'échantillons très complexes utilisant des équipements couramment dans les laboratoires de recherche 56,60. Ces tests utilisent des billes paramagnétiques liés de manière covalente à des anticorps anti-BoNT sérotypes spécifiques de lier et séquestrer BoNT sur un échantillon, puis retirez interférer composés de la matrice par lavage. Après lavage, l'activité protéolytique de BoNT lié est ensuite quantifiée dans un tampon de réaction optimisé en utilisant un rapporteur compatible avec le sérotype BoNT testé. Ces rapporteurs sont des protéines fluorogènes constitués d'un cyan N-terminal de la protéine fluorescente (PCP) du fragment et un jaune fluorescent dérivé de protéine C-terminal de la fraction (Venus) reliés par un substrat de BoNT, les résidus de SNAP25 141-206 ou les résidus Synaptobrevin 33-94 constituant l' BoTest A / E ou B / D / F / G journalistes, respectivement 45. Reporter clivage par BoNT est contrôlée en utilisant Förster transfert d'énergie par résonance (FRET). Quand til rapporteur est intact, l'excitation de la PCP en résulte FRET à Vénus, trempe PCP émission et passionnante émission Vénus. Le clivage de la reporter par la BoNT empêche FRET, conduisant à une augmentation de la PCP et de diminution de l'émission de Vénus émission. Activité BoNT peut alors être mesuré quantitativement utilisant le ratio des émissions PCP et Vénus. LOD-dessous de 3 pg sont possibles à partir d'un large éventail d'aliments en utilisant un format de plaque de 96 puits à haut débit 56. Sensibilité accrue peut être obtenue en utilisant des volumes d'échantillon plus grands depuis la concentration de dosage permet la toxine sur la surface des billes.
Les essais de la matrice BoTest pour BoNTs A, B, E, et F ont été développés et testés avec de la nourriture, des produits pharmaceutiques, et les échantillons environnementaux 56,60. Ici, nous décrivons les procédures pour exécuter ces tests pour la détection des BoNT faible complexité (par exemple, pharmaceutique, BoNT dans le tampon) et haute complexité (par exemple la nourriture, de l'environnement) des échantillons. Méthodes de traitement spécifiquespour plusieurs types d'échantillons sont traités dans ce protocole et les types d'échantillons ne sont pas décrites ici peuvent généralement être adaptées en utilisant une combinaison des méthodes présentées. Le protocole a été développé et testé avec BoNT / A, mais est adaptable à d'autres sérotypes de neurotoxines botuliques en utilisant leurs analyses respectives comme en témoigne d'ailleurs 56,60.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit les procédures permettant de quantifier BoNT / A complexe, holotoxine, ou Clostridium surnageant de culture dans des matrices complexes. Le protocole est le même, cependant, lors de l'essai d'autres sérotypes BoNT (par exemple de BoNT / B, E et F) avec leurs dosages matricielles respectives 56,60, même si la sensibilité dosage variera selon les sérotypes et dosages. Ce protocole ne tient pas compte de tous les types d'échantillon possible et certaines …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier H. Olivares et D. Ruge pour des discussions et des conseils précieux. Cette recherche a été financée en partie par une bourse NSF SBIR (PII-1127245 à BioSentinel Inc.) et un ministère de la Défense contrat (W81XWH-07-2-0045 de bien BioSentinel Inc.).
Materials
| BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit | BioSentinel | A1015 | Detection kits for BoNT/B and F are also available. |
| Varioskan Flash fluorescence microplate reader | Thermo-Fisher Scientific | 5250040 | Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 and 526 nm emission capability can be used. |
| 96-well Magnetic Bead Separation Plate | V&P Scientific | VP771H | Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well. |
| Magnetic Bead-Compatible Plate Washer | BioTek | ELx405 VSRM | Optional, only required for automated plate washing. Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use. |
| Microcentrifuge | Various | N/A | Optional, only required for samples needing centrifugation. |
| MixMate plate mixer | Eppendorf | 22674200 | |
| Orbital Shaker | Various | N/A | Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available |
| EDTA-free Protease Inhibitor Tablets | Roche | 4693132001 | Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free. |
| BoNT/A | Metabiologics | N/A | Optional, only required for standardization and quantification purposes |
| Black, Flat-bottomed 96-well Plates | NUNC | 237105 | Plates should not be treated |
| 96-well Plate Sealing Tape | Thermo Scientific | 15036 |
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