BoTestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックスからの単離およびボツリヌス神経毒素の定量化

Summary

BoTestマトリックスボツリヌス神経毒素（BoNT）検出アッセイは、急速にサンプルマトリックスの範囲からのBoNTを浄化し、定量化する。ここでは、固体と液体の両方の行列からのBoNTの検出および定量のためのプロトコルを提示し、BOTOX、トマト、ミルクを用いたアッセイを示す。

Abstract

複雑なマトリックス中のボツリヌス神経毒素（BoNT）の正確な検出および定量は、製薬、環境、食品サンプルのテストに必要とされる。正確な効力試験をするBoNTベースの薬剤製品の製造および患者の安全のために必要であるが、食品の急速なBoNT試験は流行フォレンジック、患者の診断、および食品の安全性試験の際に必要となります。のBoNTテストのための広く使用されているマウスのバイオアッセイは、高感度であるが、迅速かつ日常的なBoNTのテストに必要な精度とスループットを欠いている。さらに、動物のバイオアッセイの使用はのBoNTテストのためのマウスのバイオアッセイに代わる米国および海外での薬物製品の規制当局や動物の権利の支持者による通話をもたらしました。いくつかのインビトロ置換アッセイは、単純な緩衝液中で精製されたBoNTでうまく機能するよう開発されてきたが、ほとんどは、非常に複雑なマトリックス中の試験に適用可能であることが示されていない。ここで、検出のためのプロトコルBoTestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックス中のBoNTが提示されている。検定は3つの部分から構成されています。最初の部分はテストのためのサンプルの調製を含む、第二部は、マトリックスからのBoNTを精製する抗のBoNT抗体でコーティングされた常磁性ビーズを用いて免疫沈降ステップであり、3番目の部分は分離されたBoNTのタンパク質分解を定量化蛍光性レポーターを使用して、アクティビティ。プロトコルは、液体および固体の両方の行列を用いて96ウェルプレートでハイスループット試験のために書かれ4-26時間の合計アッセイ時間は、試料の種類、毒素負荷、および所望の感度に応じた手動製剤の約2時間を必要とする。データは、リン酸緩衝生理食塩水、医薬製品、培養上清を、2％ミルク、新鮮なトマトのBoNT / A試験のために提示され、アッセイの成功のための重要なパラメータの議論を含むている。

Introduction

ボツリヌス神経毒素（BoNTを）が知られている最も致命的な物質で、1〜3 NGと推定静脈人間の致死量に/ ^1,2キロ。七つのBoNT血清型は構造的に類似し、Gを介して標識され、各々は、サイトゾルと亜鉛エンドペプチダーゼ^3-5をコードする軽鎖への細胞結合、取り込み、および転座に関与する重鎖ドメインからなる、存在する。部分的には、その具体的な結合および神経筋接合部⁶での運動ニューロンへのエントリーからのBoNT結果の絶妙な毒性。一旦ニューロンの内部に、軽鎖エンドペプチダーゼを特異的に切断する可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質レセプター（SNARE）小胞融合に必要なタンパク質の1つ以上が、神経伝達物質放出を阻害し、弛緩性麻痺^7-14をもたらす。一般的疾患」ボツリヌス中毒」のBoNTによる横隔膜や肋間筋の麻痺として知られ、最終的には、その結果早期診断と治療しない限り、呼吸不全や死を受けている。

人間の食品媒介性ボツリヌス症は、最も一般的なBoNT血清型A、B、Eに関連付けられており、通常は、F（BoNT / A型、のBoNT / B 等 ）とは汚染された食物^15,16の摂取に起因される。たが、創傷ボツリヌス中毒のいくつかのケース静脈内薬物使用者の間で報告された^17,18。米国では、1歳未満の子供によるクロストリジウム胞子の摂取による乳児ボツリヌス症は、ボツリヌス中毒^19〜21の中で最も一般的な形式です。しかし、不適切な家庭缶詰食品加工に起因する食中毒のBoNTのアウトブレイクは、米国および海外の両方で報告された。 2000-2009の間、食品媒介性ボツリヌス症の少なくとも338例は6死亡例²²を含め世界的に報告された。迅速かつ高感度に食中毒ボツリヌス中毒の発生を検出する能力は、早期診断を支援することができ、重要な指標である^23,24。さらに、費用対効果の高い、日常食品検査できるように検出方法が改善された食料安全保障につながる。

のBoNTの神経細胞の特異性と生物学的半減期が長く、また、それ強力な治療になります。米国において、BoNT系薬剤は、化粧品の条件や眉間のしわ、頸部ジストニア、片頭痛、過活動膀胱、および斜視などの神経筋関連障害の治療のための食品医薬品局（FDA）によって承認されています。多数の「適応外」アプリケーションは、重度の筋機能不全のため^25〜28高用量治療を含む、文書化されています。過剰投与が潜在的に有害な副作用のリスクがある患者を置くながら過少が無効治療につながる可能性がある正確な毒素定量化は、正しい投与のために重要である。残念ながら、標準化された効力アッセイプロトコルはなBoNTに基づく薬剤のprodu間の単位定義不平等で、その結果、製造業者間で共有されていないCTS ^29〜31。

のBoNTのための標準的な試験は、のBoNT含有試料をマウスに腹腔内注射し、死亡者の数は1〜7日以上^16,32,33が記録されたマウスのバイオアッセイである。マウスバイオアッセイは、5月10日PGのBoNT / A ³⁴の検出限界（LOD）と非常に敏感であるが、動物使用上の倫理的な問題、高い人材育成のコストと動物施設、長いアッセイ時間、および欠如を維持標準化されたプロトコルは標準化された、アニマルフリーのBoNTテストおよび定量方法^35-39を開発するために呼び出しされた。最近、いくつかの代替のBoNT定量法は、マウスまたはそれに近いマウスバイオアッセイ感度^40-49を提供すること^が開発された。これらの方法には、一般的に、蛍光、質量分析、または免疫学的方法を使用し、動物を使用することなく、マウスのバイオアッセイよりもかなり短いアッセイ時間を提供します。免疫学的techniqと組み合わせた質量分析のアプローチUEは、食品やその他の複雑なサンプルに含まれているのBoNTを検出し、定量化することが示されたが、人材育成の必要条件と特殊な装置の制限これらのアッセイは^{、50〜55。}他のほとんどの代替のアッセイは、複雑なサンプル試験に容易に適用できないか、日常的なBoNTのテストに必要なスループットを欠いている。のBoNTの極端な効力に一致するように感度のインビトロアッセイ法を開発しようとする食品サンプルの粘度、pH、塩分、およびマトリックス構成成分の高度に可変性は、特に困難な挑戦を提示する。さらに、このようなBoNT系医薬品の再懸濁に起因するものなどであっても、単純で、比較的良性の緩衝系は、有意にインビトロ効力のBoNT ⁵⁶影響を及ぼす塩、アルブミン、および糖安定剤（ すなわち、賦形剤）を含有する。毒素精製は、サンプル^56〜59の最も単純ますが、すべての正確な活性試験のために必要である。

ザ·BoTestマトリックスアッセイは迅速で高スループットのために設計されており、一般的に研究室^56,60で見つかった機器を使用して、高度に複雑なサンプルからのBoNTの一貫した定量化された。これらのアッセイは、共有結合的に結合して、サンプルからのBoNTを封鎖した後、洗浄することによってマトリックス化合物を干渉除去して血清型特異的抗のBoNT抗体に連結常磁性ビーズを使用しています。洗浄後、結合したBoNTタンパク質分解活性は、その後のBoNT血清型は、試験されると互換性のレポーターを用いて最適化反応バッファー中で定量化される。これらのレポーターは、N末端シアン蛍光タンパク質（CFP）部分とを構成するBoNT基板、SNAP25残基141から206またはシナプトブレビン残基33から94で連結されたC末端黄色蛍光タンパク質誘導体（ヴィーナス）部分からなる蛍光性タンパク質であるBoTest A / EまたはB / D / F / Gの記者、それぞれ^45。のBoNTによるレポーター切断は、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて監視される。ときはT彼記者は、CFPの励起はCFP発光と刺激的な金星発光が消光、金星にFRETの結果、無傷である。のBoNTによるレポーターの切断は、CFP発光と金星排出量の減少の増加につながる、FRETを防ぐことができます。活性のBoNT次いで定量的にCFPと金星の発光の比率を用いて測定することができる。 3視聴以下LODは、ハイスループットの96ウェルプレートフォーマット^を使用して、食品⁵⁶の広い範囲から可能である。アッセイは、ビーズ表面上の毒素の濃度を可能にするので、感度の増加は、より大きな試料体積を用いて得ることができる。

のBoNT A、B、E、およびFのためのBoTestマトリックスアッセイは、食品、製薬、環境試料^56,60を使用して開発し、試験した。ここでは、（ 例えば 、食品、環境）のサンプル低複雑でのBoNTの検出のためのこれらのアッセイを実行するための手順（ 例えば医薬品、バッファ内のBoNT）と高い複雑性を説明しています。具体的な処理方法いくつかのサンプルタイプについて、このプロトコルで扱われており、ここでは説明しない試料の種類は、通常、提示される方法の組み合わせを使用して適合させることができる。プロトコルが開発され、テストのBoNT / Aであるが他の場所で^56,60実証されたように、それぞれのアッセイを使用して他のBoNT血清型に適用可能であるした。

Protocol

1。アッセイ試薬の調製 15分間室温（RT）で200倍ジチオスレイトール（DTT）、10×マトリックス結合緩衝液（10×結合緩衝以下）、10倍の中和緩衝液（のみ食品またはpH不均衡サンプル）、および10×BoTest反応緩衝液（10×反応緩衝以後）を解凍または完全に解凍されるまで。このプロトコルで使用されるバッファーおよび試薬のリストについては、表1を参照してください。この…

Representative Results

記載されたプロトコルにおけるステップを要約した図を図2に示されている。検定は、サンプルの種類と必要なアッセイ感度に応じて、完了するために4月26日時間の間が必要ですが、実践的な時間しか〜2時間。アッセイは、96ウェルプレート中で実施し、実行されるテストのタイプに依存している、プレート当たりの基準を含む最大20個のサンプルの三連の試験を可能…

Discussion

このプロトコルは、複雑なマトリックス中のBoNT / A複雑、ホロ毒素、またはクロストリジウム培養上清を定量化するための手順について説明します。アッセイ感度は血清型およびアッセイ間で変化するが^、56,60それぞれのマトリクスアッセイと他のBoNT血清型（ 例えばのBoNT / B、E、およびF）をテストする際のプロトコルは、しかし、同じです。このプロトコルは、可能な?…

Materials

BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit	BioSentinel	A1015	Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader	Thermo-Fisher Scientific	5250040	Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate	V&P Scientific	VP771H	Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer	BioTek	ELx405 VSRM	Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge	Various	N/A	Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer	Eppendorf	22674200
Orbital Shaker	Various	N/A	Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets	Roche	4693132001	Only required for food or environmental testing.  Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A	Metabiologics	N/A	Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates	NUNC	237105	Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape	Thermo Scientific	15036