מיקרוסקופיה photoactivated הלוקליזציה (PALM) בשילוב עם מעקב מולקולה בודדת מאפשרת התבוננות ישירה וכימות של אינטראקציות החלבון-DNA בתאי חיידקי Escherichia חיים.
אינטראקציות החלבון-DNA הן בלב של תהליכים תאיים רבים יסודיים. לדוגמא, שכפול הדנ"א, השעתוק, ותיקון, והארגון של כרומוזום נשלטים על ידי חלבוני קושרי DNA שמזהים מבני DNA ספציפיים או רצפים. בניסויים במבחנה סייעו לייצר מודלים מפורטים עבור הפונקציה של סוגים רבים של חלבוני ה-DNA מחייבת, ובכל זאת , המנגנונים של תהליכים אלה והארגון שלהם בסביבה המורכבת של התא החי המדויקים יישארו הרבה פחות מובן. לאחרונה הציגו שיטה לכימות פעילות ה-DNA-תיקון בתאי חיידקי Escherichia חיים באמצעות photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית (PALM) בשילוב עם מעקב מולקולה בודדת. הגישה הכללית שלנו מזהה אירועים-DNA מחייבת פרט על ידי השינוי בניידות של חלבון יחיד על קשר עם כרומוזום. את החלק היחסי של מולקולות מאוגדים מספק מדד כמוני ישיר לפעולת החלבוןivity ושפע של מצעים או אתרי קישור ברמת התא הבודד. כאן, אנו מתארים את הרעיון של השיטה ונדגים הכנת מדגם, רכישת נתונים, ונהלי ניתוח נתונים.
פרוטוקול זה מתאר מדידה הישירה של אינטראקציות החלבון-DNA בתאים חי Escherichia coli. הטכניקה מנצלת את השינוי במקדם הדיפוזיה של חלבון יחיד שכותרתו fluorescently כפי שהוא קושר את כרומוזום (איור 1). כדי להדגים את השיטה שאנו משתמשים DNA פולימרז (Pol1), חלבון קושר DNA טיפוסי שממלא את פערי דנ"א בשכפול גדיל מפגר ומסלולי תיקון כריתת 1.
כניסתו של מיקרוסקופ פלואורסצנטי רזולוציה סופר מאפשרת הדמיה של מבנים מולקולריים בתאים עם רזולוציה ננומטר. Photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית (PALM) מעסיק חלבוני ניאון שיכול להיות מופעל ממדינה חשוכה ראשונית למצב ניאון (איור 2). רק קבוצת משנה של כל המולקולות שכותרתו מופעלת בכל עת כדי לקבוע את עמדותיהם באופן רציף, באופן בלתי תלוי tהוא בסך הכל ריכוז של מולקולות שכותרתו במדגם 2. דיוק הלוקליזציה לכל מולקולה בעיקר תלוי בגודל של פונקצית התפשטות נקודת הניאון (כוחות הביטחון הפלסטיניים), מספר הפוטונים שנאספו, ואות רקע 3. יישומים של שיטה זו רבים להתמקד בויזואליזציה המשופרת של מבנים הסלולר. ההבנה שניתן לשלב PALM עם מולקולה בודדת מעקב 4 נפתחו אפיקים חדשים לעקוב באופן ישיר את התנועה של מספרים שרירותיים של חלבונים שכותרתו בתאים חיים. רגישות מוגברת והחלטה זמנית של מיקרוסקופים הקרינה מאפשרים כעת מעקב של חלבוני ניאון לשדר אחת בציטופלסמה חיידקי 5.
כאן, אנחנו מעסיקים PAmCherry, חלבון פלואורסצנטי מהונדס שאופן בלתי הפיך ממיר ממדינת nonfluorescent ראשונית למצב ניאון על הקרנה עם 405 ננומטר אור 6. fluorophores PAmCherry הופעל יכול להיות תמונהד על ידי עירור ב 561 ננומטר ולעקוב אחריו במשך כמה מסגרות עד photobleaching. אנחנו מדגימים את יכולתה של השיטה לזיהוי אירועים-DNA מחייבת חולפים של חלבונים בודדים באמצעות שילוב של Pol1 וPAmCherry. טיפול בתאים עם methanesulfonate מתיל (MMS) גורם נזק מתילציה דנ"א שהפך למצעי DNA ומרווחים על ידי אנזימים לתיקון בסיס כריתה. השיטה שלנו מראה ברורה מחייבת של מולקולות Pol1 אחת בתגובה לנזק MMS 7.
אנו דנים כמה שיקולים מרכזיים להצלחה של הניסוי.
בחירה וביטוי של חלבון היתוך הניאון: יש לוח גדול של חלבוני ניאון photoactivatable וphotoswitchable 17. הבחירה הספציפית תלויה במאפייני מיקרוסקופ, במיוחד הלייזרים והמסננים זמינים. השילוב של 405 ננומטר ו561 ננומטר הוא אידיאלי עבור חלבוני ניאון photoactivatable משותפים. בחרנו PAmCherry 6 כי זה monomeric ולא הראיתי צבירה בתאים. יתר על כן, photoactivation בלתי הפיך מאפשר לספור את מספר fluorophores הופעל כדי למדוד מספרי עותק חלבון לכל תא. במקום להביע את חלבון ההיתוך מפלסמיד, אנו מעדיפים החדרה הכרומוזומלי של הגן המקודד לחלבון ההיתוך במוקד wild-type. זה מבטיח החלפה של החלבון של עניין להשלים עם הניאון version ושמירה על רמת ביטוי wild-type.
שיעור photoactivation: חשוב להתאים את קצב כזה photoactivation כי בממוצע פחות ממולקולה אחת לכל תא נמצאת במצב הניאון בכל מסגרת של הסרט. זה תלוי בעוצמת 405 ננומטר ומספר המולקולות עזב כדי להיות מופעל. בצפיפויות הדמיה נמוכות מאוד, עם זאת, לא כל המולקולות יהיו צילמו לפני סוף הסרט או סרטים ארוכים מאוד צריכים להיות נרכשים. מספר המסגרות שנרשמו לכל סרט תלוי במספר העותק של חלבוני היתוך לכל תא וכל החיים הממוצעים photobleaching של PAmCherry בתנאי העירור בשימוש. עותק מספר Pol1 הוא ~ 400 מולקולות / הערך הממוצע של התפלגות החיים photobleaching מעריכי תא 1 והיה ~ 4 מסגרות. על ידי הגדלת עוצמת 405 ננומטר בהדרגה, ההפעלה מופצת באופן שווה על פני 10,000 המסגרות של הסרט. לכן, כל תא הוא occupמטען על ידי מולקולות ניאון עבור סכום כולל של ~ 1,600 מסגרות, להבטיח חפיפה מועטת של PSFs וסיבוכים מעקב בסרט של 10,000 מסגרות.
עוצמות זמן חשיפה ועירור: בראש ובראשונה, זמני חשיפה צריכה להיות קצר מספיק כדי להתבונן PSFs החד בתנועה קצת טשטוש. עם זאת, יש לבחור את מסגרת הדולר להניב תנועה מולקולרית נצפית בין מסגרות רצופות מעבר לחוסר ודאות הלוקליזציה, אחרת פוטונים חיוניים מבוזבזים על ידי oversampling המסלול. התנועה של מולקולות מאוגדים יש נדגם במרווחי זמן ארוך מספיק כדי להיות מובחן מהתנועה הנראית של מולקולות מחויבות בשל אי וודאות הלוקליזציה באופן ברור. כשהזמן החשיפה מוגדר, צריכה להיות מותאמת עוצמת כוחות הביטחון הפלסטיניים. דיוק הלוקליזציה של כוחות הביטחון הפלסטיניים עולה עם מספר הפוטונים זוהו על משך הזמן של מסגרת. עוצמות עירור גבוהות יותר להגדיל את bu שיעור פליטת הפוטוןt גם שיעור photobleaching ואות רקע. השתמש בעוצמת העירור הנמוכה ביותר שנותנת את דיוק הלוקליזציה הרצויה. לPol1-PAmCherry בחרנו 15.26 msec / מסגרת ו3.5 עירור mW 561 ננומטר (400 W / 2 סנטימטר). זה חשוב כדי לאשר תא כדאיות לתנאי הדמיה מסוימים על ידי ניטור צמיחת תאים ומורפולוגיה לפני ואחרי רכישת נתונים (ראה מידע נוסף בUphoff et al. 7).
Pol1 מפגין זמן מחייב של ~ 2 שניות למצע ה-DNA ומרווחות in vivo 7, ולכן אנו מצפים שרוב המולקולות להיות גם במדינה המאוגדת או לא מאוגדת עבור כל משך הזמן של מסלול. מולקולות Bound מופיעות בעצם נייחות כי יש לי אתרי כרומוזום מקדם הדיפוזיה כמה סדרי גודל נמוך יותר (~ 10 -5 מיקרומטר 2 / sec, אלמור ואח'. 18) מאשר דיפוזיה Pol1 בציטופלסמה (~ 1 מיקרומטר 2 </sעד> / sec).
ניתוח דיפוזיה: * D מקדם הדיפוזיה לכאורה מחושב מMSD של שירים בודדים, בממוצע למינימום של 4 שלבים (5 מסגרות) כדי להפחית את השגיאה הסטטיסטית. שים לב ש~ 75% ממולקולות אקונומיקה בתוך פחות מ -5 מסגרות לתנאי ההדמיה מתוארות. מסלולים קצרים כל כך לא מספקים ודאות סטטיסטית מספיק כדי להבחין מולקולות מאוגדת ומאוגדות. עם זאת, שברים היחסי של מולקולות מאוגדים ולא מאוגדים שידווחו על פעילות החלבון אינם תלויים במספר הכולל של מסלולים מנותחים.
זה שימושי כדי להסביר את שגיאת לוקליזציה כוחות הביטחון הפלסטיניים (loc σ) בחישוב * D בגלל חוסר הוודאות מוסיפה צעד אקראי לכאורה זה לזה לוקליזציה של מולקולה 15.
כדי לשפר את הסיווג של מולקולות מאוגדים ולשדר, אנו ממליצים על חישוב D בוט *שעות מההתקות בשלב יחיד וההתקות לאורך הזמן של שתי מסגרות. אז זה אפשרי לקבוע שני ספים נפרדים D *: * D (15 אלפיות שני) <0.15 מיקרומטר 2 / sec ו* D (30 אלפיות שני) <0.075 מיקרומטר 2 / sec.
שים לב ש* D הוא מקדם הדיפוזיה ברורה שהוא מושפע כליאת תא של המסילה ותנועת טשטוש עקב דיפוזיה בזמן החשיפה. כדי לחלץ מקדמי דיפוזיה משוחד מדויקים, היא הוכיחה שימושית כדי להשוות את ההצעה שנצפתה לנתונים מלאכותיים המבוססים על 5,7 מודל תנועה הבראונית סטוכסטיים. גם נתוני סימולציה יכולים לשמש כדי לבדוק את נהלי ניתוח נתונים.
יישומים אפשריים של שיטה זו: אנחנו תיארתי גישה כללית המאפשר הדמיה וכימות אינטראקציות-DNA חלבון in vivo על ידי השינוי בניידות של חלבון על כריכה לכרומוזום. הפעילויות של ה-DNA אומחייב חלבוני RNA המעורבים בתיקון, שכפול, שעתוק, ותחזוקת כרומוזום לכן יכולים להיות מיושמים בזמן אמת ברמת התא הבודד עם רזולוציה מרחבית מתחת לגבול ההשתברות האופטית. מעקב מולקולה בודדת photoactivated מרחיב שיטות מעקב קונבנציונליות, כי הם מוגבלים לכמה מולקולות שכותרת לכל תא. שיטה חלופית המודדת דיפוזיה מולקולרית in vivo היא שחזור הקרינה לאחר Photobleaching (FRAP). בעוד FRAP הוא שימושי מאוד למדידת מאפייני הדיפוזיה העולמית בתאים גדולים, הוא מוגבל ביכולתה כדי לפתור כמה מינים מולקולריים עם mobilities שונה בסביבה מרחבית הטרוגנית, במיוחד לתאי חיידקים קטנים.
יש לנו ליישם מולקולה בודדת photoactivated מעקב כדי למדוד את פעילות ה-DNA מחייבת ומגוירים subcellular של מגוון רחב של חלבונים שונים בE. coli כולל Pol1, האנזים DNA, חלבון ה-FIS, ה-DNAפולימראז III 7, כמו גם תחזוקה המבנית של חלבוני כרומוזומים MukB, E, ו-F 19. אנו צופים את השיטה גם יכולה להיות מותאמת לסוגי תאים אחרים.
The authors have nothing to disclose.
אנו מכירים ג'סטין פינקני ויוהנס Hohlbein לעזרה בבנייה של מיקרוסקופ העידו ושיימוס הולדן עבור תוכנת הלוקליזציה. רודריגו רייס-למוט הוא הודה למתן א זן חיידק. המחקר מומן על ידי הבריאות-F4-2008-201,418 נציבות האירופיות תכנית המסגרת השביעית גרנט FP7/2007-2013, בריטניה ביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה המועצה למחקר גרנט BB/H01795X/1, והמועצה האירופית למחקר גרנט 261,227 לANK. DJS מומן על ידי Wellcome Trust Program גרנט WT083469. SU נתמכה על ידי דוקטורט MathWorks.
E.coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein | created by Lambda-Red recombination | ||
MEM amino acids | Invitrogen | 11130-051 | minimal medium supplement |
MEM vitamins | Invitrogen | 11120-052 | minimal medium supplement |
Agarose | BioRad | 161-3100 | certified molecular biology grade |
Microscope coverslips No 1.5 thickness | Menzel | BB024060SC | remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h |
Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma-Aldrich | 129925 | CAUTION: toxic |
PALM setup | home-built | described in Uphoff et al. 2013 | |
MATLAB | MathWorks | for data analysis and visualization | |
Localization software | custom-written, available online | http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html | MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al. 2010 if used in publication. |
Tracking software | available online | http://physics.georgetown.edu/matlab/ | MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker & Grier 1996 if used in publication. |