Fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) in combinatie met single-molecule-tracking maakt directe observatie en kwantificering van eiwit-DNA-interacties in levende Escherichia coli cellen.
Eiwit-DNA-interacties in het hart van vele fundamentele cellulaire processen. Bijvoorbeeld, DNA-replicatie, transcriptie, reparatie en chromosoom organisatie onder DNA-bindende eiwitten die specifieke DNA-structuren of sequenties herkennen. In vitro experimenten hebben bijgedragen gedetailleerde modellen voor de functie van vele soorten DNA-bindende eiwitten te genereren, maar De exacte mechanismen van deze processen en hun organisatie in de complexe omgeving van de levende cel blijven veel minder begrepen. We hebben onlangs introduceerde een methode voor het kwantificeren van DNA-reparatie-activiteiten in levende Escherichia coli cellen met behulp Photoactivated Lokalisatie Microscopy (PALM) in combinatie met single-molecule tracking. De algemene benadering identificeert individuele DNA bindingsgebeurtenissen door de verandering in de mobiliteit van een eiwit bij associatie met het chromosoom. De fractie van gebonden moleculen biedt een directe kwantitatieve maat voor het eiwit activity en overvloed van substraten of bindingsplaatsen op het eencellige niveau. Hier beschrijven we het concept van de werkwijze en demonstreren monstervoorbereiding, data acquisitie en procedures gegevensanalyse.
Dit protocol beschrijft de directe meting van eiwit-DNA-interacties in levende Escherichia coli cellen. De techniek maakt gebruik van de wijziging van de diffusiecoëfficiënt van een fluorescent gelabeld eiwit als het bindt het chromosoom (figuur 1). De methode die wij gebruiken DNA polymerase I (Pol1), een prototypisch DNA-bindend eiwit dat DNA gaten in bekledings bundel replicatie en excisie pathways 1 vult tonen.
De komst van de super-resolutie fluorescentie microscopie maakt visualisatie van moleculaire structuren in cellen met nanometer resolutie. Fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) maakt gebruik van fluorescerende eiwitten die kunnen worden geactiveerd vanuit een eerste donkere toestand naar een fluorescerende toestand (figuur 2). Slechts een deel van alle gemerkte moleculen geactiveerd allen tijde de positie te bepalen op een sequentiële wijze, onafhankelijk van de thij totaal concentratie van gemerkte moleculen in het monster 2. De lokalisatie precisie per molecuul hangt vooral af van de grootte van de fluorescerende puntspreidingsfunctie (PSF), het aantal verzamelde fotonen, en de achtergrond signaal 3. Vele toepassingen van deze methode gericht op de verbeterde visualisatie van cellulaire structuren. Het besef dat PALM kan worden gecombineerd met single-molecule volgen 4 nieuwe wegen geopend voor direct volgen de beweging van willekeurige getallen van gelabelde eiwitten in levende cellen. Verhoogde gevoeligheid en temporele resolutie van fluorescentie microscopen nu is het volgen van enkele diffusie fluorescerende eiwitten toestaan in het bacteriële cytoplasma 5.
Hier maken we PAmCherry, een fluorescent proteïne dat onomkeerbaar converteert van een eerste niet-fluorescerende toestand naar een fluorescerende staat bij bestraling met 405 nm licht 6. Geactiveerde PAmCherry fluoroforen kan imagod door excitatie bij 561 nm en bijgehouden voor verschillende frames tot fotobleken. We tonen het vermogen van de methode om voorbijgaande DNA-bindende gebeurtenissen van enkele eiwitten te identificeren met behulp van een fusie van Pol1 en PAmCherry. Behandeling van cellen met methylmethaansulfonaat (MMS) veroorzaakt DNA-methylatie schade die wordt omgezet in gapped DNA substraten door base-excisie reparatie-enzymen. Onze methode toont duidelijke binding van enkele Pol1 moleculen in reactie op MMS schade 7.
We bespreken een aantal belangrijke overwegingen voor het succes van het experiment.
Keuze en expressie van de fluorescente fusie-eiwit: Er is een groot palet van fotoactiveerbare en photoswitchable fluorescerende eiwitten 17. De specifieke keuze hangt af van de microscoop eigenschappen, met name de lasers en filters beschikbaar. De combinatie van 405 nm en 561 nm is ideaal voor zachte licht activeerbare fluorescente proteïnen. We kozen PAmCherry 6 omdat het monomere en toonde geen aggregatie in cellen. Bovendien onomkeerbare fotoactivatie kan tellen van het aantal geactiveerde fluoroforen eiwit aantal kopieën per cel te meten. In plaats van het fusie-eiwit expressie van een plasmide, wij prefereren chromosomale insertie van het gen dat codeert voor het fusie-eiwit op het wildtype locus. Dit zorgt voor een volledige vervanging van het eiwit van belang met de fluorescerende version en onderhouden van de wild-type expressie niveau.
Fotoactivatie rate: Het is belangrijk de fotoactivatie zodanig dat gemiddeld minder dan een molecule per cel in de fluorescerende toestand in elk frame van de film aan te passen. Dit hangt af van 405 nm intensiteit en het aantal moleculen nog moet worden geactiveerd. Bij zeer lage dichtheden beeldvorming echter niet alle moleculen worden afgebeeld voor het einde van de film of zeer lange films moeten worden verkregen. Het aantal opgenomen frames per film afhankelijk van het aantal kopieën van fusie-eiwitten per cel en de gemiddelde levensduur van fotobleken PAmCherry bij excitatie omstandigheden. Het aantal kopieën van Pol1 is ~ 400 moleculen / cel 1 en de gemiddelde waarde van de exponentiële photobleaching levensduurverdeling was ~ 4 frames. Door het verhogen van de 405 nm intensiteit geleidelijk wordt de activering gelijkmatig over het 10.000 frames van de film. Daarom heeft elke cel Occupied van fluorescerende moleculen in totaal ~ 1600 frames, zodat weinig overlap van PSF en tracking complicaties in een film van 10.000 frames.
Belichtingstijd en excitatie intensiteiten: Foremost, belichtingstijden moet kort genoeg zijn om scherpe PSF's waarnemen met weinig beweging vervagen. Echter, de framesnelheid worden verkozen om waarneembare moleculaire beweging tussen opeenvolgende frames buiten de lokalisatie onzekerheid opleveren, anders cruciale fotonen worden verspild door oversampling het spoor. De beweging van ongebonden moleculen moeten bemonsterd voldoende lange tijdsintervallen duidelijk van de schijnbare beweging van gebonden moleculen door de lokalisatie onzekerheid zijn. Als de belichting is ingesteld, moet de PSF intensiteit worden aangepast. De lokalisatie precisie van een PSF neemt toe met het aantal gedetecteerde fotonen over de duur van een frame. Hogere excitatie intensiteit verhogen het foton emissie but ook de photobleaching tarief en de achtergrond signaal. Gebruik de laagste excitatie intensiteit die de gewenste lokalisatie precisie geeft. Voor Pol1-PAmCherry kozen we 15.26 msec / frame en 3,5 mW 561 nm excitatie (400 W / cm 2). Het is belangrijk om cellevensvatbaarheid voor de specifieke beeldomstandigheden bevestigen controle celgroei en morfologie voor en na de data-acquisitie (zie aanvullende informatie in Uphoff et al.. 7).
Pol1 vertoont een bindende tijd van ~ 2 sec tot een gapped DNA substraat in vivo 7, daarom verwachten we dat de meerderheid van de moleculen te worden, hetzij in de gebonden of ongebonden toestand voor de gehele duur van een track. Gebonden moleculen lijken hoofdzaak onbeweeglijk vanwege chromosoom sites hebben een diffusiecoëfficiënt verschillende orden van grootte lager (-10 -5 micrometer 2 / sec, Elmore et al.. 18) dan Pol1 diffusie in het cytoplasma (~ 1 micrometer 2 </sinschrijven> / sec).
Diffusion analyse: De schijnbare diffusiecoëfficiënt D * wordt berekend uit de MSD van individuele tracks, gemiddeld over een minimum van 4 stappen (5 frames) om de statistische fouten te verminderen. Merk op dat ~ 75% van moleculen bleken in minder dan 5 frames voor de beeldvorming voorwaarden beschreven. Dergelijke korte tracks niet voldoende statistische zekerheid aan gebonden en ongebonden moleculen onderscheiden. De relatieve fractie van gebonden en ongebonden moleculen die rapporteren over de eiwitactiviteit zijn onafhankelijk van het totaal aantal tracks geanalyseerd.
Het is nuttig om rekening te houden PSF lokalisatiefout (σ loc) bij de berekening van D * omdat de onzekerheid voegt een schijnbare willekeurige stap elk lokalisatie van een molecuul 15.
De indeling van de gebonden en de verspreiding van moleculen te verbeteren, raden wij berekenen D * both van de single-step verplaatsingen en de verplaatsingen in de tijd van twee frames. Het is dan mogelijk om twee D * drempels: D * (15 msec) <0,15 micrometer 2 / sec en D * (30 msec) <0.075 um 2 / sec.
Merk op dat D * is een schijnbare diffusiecoëfficiënt die wordt beïnvloed door de cel opsluiting van de tracks en beweging vervagen door diffusie tijdens de belichtingstijd. Om nauwkeurige onpartijdige diffusiecoëfficiënten halen, is het nuttig om de waargenomen beweging vergelijken met gesimuleerde data op basis van een stochastisch Brownse beweging model 5,7 bewezen. Gesimuleerde gegevens kunnen ook worden gebruikt voor procedures gegevensanalyse testen.
Potentiële toepassingen van deze methode: We beschreven een algemene aanpak voor het visualiseren en kwantificeren van eiwit-DNA-interacties in vivo door de verandering in de mobiliteit van een eiwit bij binding aan het chromosoom. De activiteiten van DNA-ofRNA-bindende eiwitten betrokken bij herstel, replicatie, transcriptie en chromosoom onderhoud kan dus worden gevolgd in real time in het eencellige niveau met een ruimtelijke resolutie onder het optische diffractie limiet. Fotogeactiveerde single-molecule bijhouden breidt conventionele opsporingsmethoden die zijn beperkt tot een paar gelabelde moleculen per cel. Een alternatieve methode die moleculaire diffusie in vivo meet is Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP). Terwijl FRAP is zeer nuttig voor het meten van globale diffusie eigenschappen in grote cellen wordt beperkt in zijn vermogen om verschillende moleculaire soorten met verschillende mobiliteiten lossen in een ruimtelijk heterogene omgeving, vooral voor kleine bacteriecellen.
We hebben fotogeactiveerde individuele molecuul toegepast volgen op DNA-bindende activiteiten en subcellulaire lokalisatie van een aantal verschillende eiwitten in E. meten coli waaronder Pol1, DNA-ligase, Fis eiwitten, DNApolymerase III 7, evenals structurele onderhoud van Chromosomen eiwitten MukB, E en F 19. Wij voorzien de werkwijze kan ook worden aangepast aan andere celtypen.
The authors have nothing to disclose.
Wij erkennen Justin Pinkney en Johannes Hohlbein voor hulp bij de bouw van de op maat gemaakte microscoop en Seamus Holden voor de lokalisatie van software. Rodrigo Reyes-Lamothe wordt bedankt voor het verstrekken van de E. coli-stam. Het onderzoek werd gefinancierd door de Europese Commissie Zevende Kaderprogramma Grant FP7/2007-2013 HEALTH-F4-2008-201418, UK biotechnologie en biologische wetenschappen Research Council Grant BB/H01795X/1, en de European Research Council Grant 261.227 naar ANK. DJS werd gefinancierd door een Wellcome Trust Program Grant WT083469. SU werd ondersteund door een MathWorks doctorale fellowship.
E.coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein | created by Lambda-Red recombination | ||
MEM amino acids | Invitrogen | 11130-051 | minimal medium supplement |
MEM vitamins | Invitrogen | 11120-052 | minimal medium supplement |
Agarose | BioRad | 161-3100 | certified molecular biology grade |
Microscope coverslips No 1.5 thickness | Menzel | BB024060SC | remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h |
Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma-Aldrich | 129925 | CAUTION: toxic |
PALM setup | home-built | described in Uphoff et al. 2013 | |
MATLAB | MathWorks | for data analysis and visualization | |
Localization software | custom-written, available online | http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html | MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al. 2010 if used in publication. |
Tracking software | available online | http://physics.georgetown.edu/matlab/ | MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker & Grier 1996 if used in publication. |