Fotoattivati microscopia localizzazione (PALM) in combinazione con inseguimento singola molecola permette l'osservazione diretta e la quantificazione delle interazioni proteina-DNA in cellule di Escherichia coli vive.
Interazioni proteina-DNA sono al centro di molti processi cellulari fondamentali. Ad esempio, la replicazione del DNA, trascrizione, riparazione, e l'organizzazione dei cromosomi sono regolati da proteine che legano il DNA che riconoscono strutture o sequenze di DNA specifiche. Negli esperimenti in vitro hanno contribuito a generare modelli dettagliati per la funzione di molti tipi di proteine che legano il DNA, ma , i meccanismi esatti di questi processi e la loro organizzazione nel complesso contesto della cellula vivente rimangono molto meno comprensibili. Abbiamo recentemente introdotto un metodo per quantificare le attività di riparazione del DNA in cellule di Escherichia coli vive con fotoattivati localizzazione Microscopy (PALM) in combinazione con inseguimento singola molecola. Il nostro approccio generale identifica singoli eventi che legano il DNA dal cambiamento nella mobilità di una singola proteina upon associazione con il cromosoma. La frazione di molecole legate fornisce una misura quantitativa diretta per l'atto proteinaivity e l'abbondanza di substrati o siti di legame a livello di singola cellula. Qui, descriviamo il concetto del metodo e dimostrare la preparazione del campione, l'acquisizione dei dati e procedure di analisi dati.
Questo protocollo descrive la misurazione diretta delle interazioni proteina-DNA in cellule viventi Escherichia coli. La tecnica utilizza la variazione del coefficiente di diffusione di una singola proteina fluorescente come si lega il cromosoma (Figura 1). Per illustrare il metodo che usiamo DNA polimerasi I (Pol1), una proteina di legame al DNA prototipo che colma le lacune di DNA in replicazione filamento in ritardo e percorsi di riparazione escissione 1.
L'avvento del super-risoluzione microscopia a fluorescenza consente la visualizzazione di strutture molecolari in cellule con risoluzione nanometrica. Fotoattivati localizzazione Microscopy (PALM) impiega proteine fluorescenti che possono essere attivate da uno stato oscuro iniziale ad uno stato fluorescente (Figura 2). Solo un sottoinsieme di tutte le molecole marcate viene attivata in qualsiasi momento per determinare le loro posizioni in maniera sequenziale, indipendentemente tegli concentrazione totale di molecole marcate nel campione 2. La precisione di localizzazione per molecola dipende principalmente dalle dimensioni del fluorescente Point Spread Function (PSF), il numero di fotoni raccolti, e il segnale di fondo 3. Molte applicazioni di questo metodo si concentrano sulla migliore visualizzazione delle strutture cellulari. La realizzazione che Palm può essere combinato con singola molecola inseguimento 4 aperto nuove strade per seguire direttamente il movimento dei numeri arbitrari di proteine marcate nelle cellule viventi. Aumento della sensibilità e risoluzione temporale di microscopi a fluorescenza permettono ora il monitoraggio delle proteine fluorescenti diffondenti singoli nel citoplasma batterico 5.
Qui, impieghiamo PAmCherry, una proteina fluorescente ingegnerizzato che converte irreversibilmente da uno stato non fluorescente stato iniziale ad uno fluorescente durante l'irradiazione con luce 405 nm 6. Fluorofori PAmCherry attivati possono essere immagined da eccitazione a 561 nm e monitorati per diversi fotogrammi fino photobleaching. Dimostriamo la capacità del metodo per identificare transitori eventi che legano il DNA di singole proteine utilizzando una fusione di Pol1 e PAmCherry. Il trattamento di cellule con methanesulfonate metile (MMS) provoca danni al DNA metilazione che viene trasformato in substrati DNA gapped da enzimi di riparazione di base escissione. Il nostro metodo mostra chiaramente vincolante delle singole molecole Pol1 in risposta al danno MMS 7.
Discutiamo diverse considerazioni chiave per il successo dell'esperimento.
Scelta e l'espressione della proteina di fusione fluorescente: Vi è una grande tavolozza di proteine fluorescenti photoactivatable e photoswitchable 17. La scelta specifica dipende dalle caratteristiche del microscopio, in particolare i laser e filtri disponibili. La combinazione di 405 nm e 561 nm è ideale per proteine fluorescenti photoactivatable comuni. Abbiamo scelto PAmCherry 6 perché è monomerica e mostrato alcuna aggregazione nelle cellule. Inoltre, fotoattivazione irreversibile consente di conteggiare il numero di fluorofori attivati per misurare il numero di copie per cellula proteina. Invece di esprimere la proteina di fusione da un plasmide, preferiamo inserimento cromosomica del gene codificante per la proteina di fusione al wild-type locus. Questo assicura la completa sostituzione della proteina di interesse con il fluorescente versione e mantenendo il livello di espressione wild-type.
Tasso fotoattivazione: è importante regolare il tasso di fotoattivazione tale che in media meno di una molecola per cella è nello stato fluorescente in qualsiasi fotogramma del film. Questo dipende dall'intensità 405 nm e il numero di molecole lasciato da attivare. A densità molto bassa di imaging, tuttavia, non tutte le molecole saranno ripreso prima della fine del film o filmati molto lunghi devono essere acquisita. Il numero di fotogrammi registrati al film dipende dal numero di copie di proteine di fusione per cellula e la media photobleaching durata PAmCherry alle condizioni di eccitazione utilizzati. Il numero di copie di Pol1 è ~ 400 molecole / cella 1 e il valore medio della distribuzione vita photobleaching esponenziale era ~ 4 fotogrammi. Aumentando l'intensità 405 nm gradualmente, l'attivazione viene uniformemente distribuito sulle 10.000 fotogrammi del film. Pertanto, ogni cella è chiavied da molecole fluorescenti per un totale di ~ 1.600 fotogrammi, garantendo poca sovrapposizione di PSF e complicazioni inseguimento in un film di 10.000 fotogrammi.
Tempo di esposizione e di eccitazione intensità: Primo, i tempi di esposizione devono essere sufficientemente breve da osservare PSF nitide con poco movimento sfocatura. Tuttavia, il frame rate dovrebbe essere scelto per produrre il movimento molecolare osservabile tra i fotogrammi successivi al di là dell'incertezza localizzazione, altrimenti fotoni cruciali sono sprecati dal sovracampionamento pista. Il movimento delle molecole non legate deve essere campionato a intervalli di tempo sufficientemente lungo da essere chiaramente distinguibile dal moto apparente delle molecole legate a causa dell'incertezza localizzazione. Quando è impostato il tempo di esposizione, l'intensità PSF deve essere regolata. La precisione di localizzazione di un PSF aumenta con il numero di fotoni rilevati lungo la durata di un frame. Elevate intensità di eccitazione aumentano i bu tasso di emissione di fotonit anche il tasso photobleaching e segnale di fondo. Utilizzare l'intensità di eccitazione più bassa che dà la precisione di localizzazione desiderata. Per Pol1-PAmCherry abbiamo scelto 15.26 msec / telaio e 3,5 mW 561 nm di eccitazione (400 W / cm 2). È importante confermare vitalità cellulare per le condizioni di imaging particolare monitorando la crescita cellulare e la morfologia prima e dopo l'acquisizione dei dati (vedere informazioni supplementari Uphoff et al. 7).
Pol1 presenta un tempo di legame di ~ 2 sec per un substrato DNA gapped in vivo 7; ci aspettiamo quindi la maggior parte delle molecole di essere sia nello stato associato o non associato per l'intera durata della traccia. Molecole legate appaiono sostanzialmente immobile perché i siti cromosomiche hanno un coefficiente di diffusione di diversi ordini di grandezza inferiore (~ 10 -5 micron 2 / sec, Elmore et al. 18) che Pol1 diffusione nel citoplasma (~ 1 micron 2 </sup> / sec).
Analisi Diffusione: L'apparente coefficiente di diffusione D * viene calcolato dalla MSD delle singole tracce, in media su un minimo di 4 punti (5 fotogrammi) per ridurre l'errore statistico. Si noti che ~ 75% di molecole candeggiare entro meno di 5 fotogrammi per le condizioni di imaging descritte. Tali brani brevi non forniscono certezza statistica sufficiente per distinguere molecole legati e non legati. Tuttavia, le relative frazioni di molecole legati e non legati che informano l'attività della proteina sono indipendenti dal numero totale dei brani analizzati.
È utile per spiegare la errore di localizzazione PSF (σ loc) nel calcolo di D * perché l'incertezza aggiunge un passo casuale apparente per ciascuna localizzazione di una molecola 15.
Per migliorare la classificazione delle molecole legate e diffondenti, si consiglia di calcolo D * both da spostamenti solo stadio, e gli spostamenti sul tempo di due telai. E 'quindi possibile impostare due soglie * D distinti: D * (15 msec) <0,15 micron 2 / sec e D * (30 msec) <0,075 micron 2 / sec.
Si noti che D * è un coefficiente di diffusione apparente che è influenzata da confinamento delle cellule dei brani e movimento di sfocatura dovuta al trasudamento durante il tempo di esposizione. Per estrarre i coefficienti di diffusione imparziali precise, si è dimostrato utile per confrontare il moto osservato ai dati simulati sulla base di un modello stocastico browniano movimento 5,7. Dati simulati possono anche essere usati per testare le procedure di analisi dei dati.
Le potenziali applicazioni di questo metodo: Abbiamo descritto un approccio generale per la visualizzazione e la quantificazione delle interazioni proteina-DNA in vivo dalla variazione della mobilità di una proteina dopo il legame al cromosoma. Le attività di DNA-oRNA-binding proteins coinvolte nella riparazione, replicazione, trascrizione e manutenzione cromosoma possono così seguire in tempo reale a livello di singola cellula con una risoluzione spaziale di sotto del limite di diffrazione ottica. Fotoattivati inseguimento singola molecola si estende metodi di monitoraggio tradizionali che si limitano a poche molecole marcate per cella. Un metodo alternativo che misura la diffusione molecolare in vivo è Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP). Mentre FRAP è molto utile per misurare le caratteristiche di diffusione globali a grandi cellule, è limitato nella sua capacità di risolvere diverse specie molecolari con differenti mobilità in un ambiente spazialmente eterogeneo, soprattutto per le piccole cellule batteriche.
Abbiamo applicato fotoattivati singola molecola di monitoraggio per misurare le attività che legano il DNA e le localizzazioni subcellulari di una gamma di diverse proteine in E. coli compresi Pol1, ligasi del DNA, proteine Fis, DNApolimerasi III 7, così come la manutenzione strutturale dei cromosomi proteine MukB, E, e F 19. Anticipiamo il metodo può essere adattato anche ad altri tipi di cellule.
The authors have nothing to disclose.
Riconosciamo Justin Pinkney e Johannes Hohlbein aiuto per la costruzione del microscopio su misura e Seamus Holden per il software di localizzazione. Rodrigo Reyes-Lamothe si ringrazia per la fornitura del E. coli ceppo. La ricerca è stata finanziata dalla Commissione Europea Settimo programma quadro di Grant FP7/2007-2013 SALUTE-F4-2008-201418, UK Biotecnologie e Scienze Biologiche Research Council di Grant BB/H01795X/1, e il Consiglio europeo Research Grant 261.227 a ANK. DJS è stato finanziato da un programma Wellcome trust di Grant WT083469. SU è stato sostenuto da una borsa di studio di dottorato MathWorks.
E.coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein | created by Lambda-Red recombination | ||
MEM amino acids | Invitrogen | 11130-051 | minimal medium supplement |
MEM vitamins | Invitrogen | 11120-052 | minimal medium supplement |
Agarose | BioRad | 161-3100 | certified molecular biology grade |
Microscope coverslips No 1.5 thickness | Menzel | BB024060SC | remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h |
Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma-Aldrich | 129925 | CAUTION: toxic |
PALM setup | home-built | described in Uphoff et al. 2013 | |
MATLAB | MathWorks | for data analysis and visualization | |
Localization software | custom-written, available online | http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html | MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al. 2010 if used in publication. |
Tracking software | available online | http://physics.georgetown.edu/matlab/ | MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker & Grier 1996 if used in publication. |