Photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM) kombinert med single-molekyl sporing tillater direkte observasjon og kvantifisering av protein-DNA vekselvirkninger i levende Escherichia coli-celler.
Protein-DNA interaksjoner er i hjertet av mange grunnleggende cellulære prosesser. For eksempel er DNA-replikasjon, transkripsjon, reparasjon og kromosom organisasjon styrt av DNA-bindende proteiner som gjenkjenner spesifikke DNA-konstruksjoner eller-sekvenser. In vitro eksperimenter har bidratt til å generere detaljerte modeller for funksjonen av mange typer av DNA-bindende proteiner, men , de nøyaktige mekanismer for disse prosessene og organiseringen i det komplekse miljø av den levende cellen forblir langt mindre forstått. Vi har nylig introdusert en metode for å kvantifisere DNA-reparasjonsvirksomhet i levende Escherichia coli-celler ved hjelp Photoactivated Lokalisering Mikros (PALM) kombinert med single-molekyl sporing. Det generelle tilnærmingen identifiserer individuelle DNA-bindende arrangementer av endringen i mobilitet av et enkelt protein på assosiasjon med kromosomet. Fraksjonen av bundne molekyler gir en direkte kvantitativt mål for protein handlingivity og overflod av substrater eller bindingssteder på enkelt-celle-nivå. Her beskriver vi begrepet metoden og demonstrere prøveopparbeidelse, datainnsamling, og prosedyrer for dataanalyse.
Denne protokollen beskriver den direkte måling av protein-DNA-interaksjoner i levende Escherichia coli-celler. Teknikken utnytter endringen i diffusjonskoeffisienten av en enkelt fluorescensmerkede protein som det binder kromosomet (fig. 1). For å demonstrere den metoden vi bruker DNA polymerase I (Pol1), en prototypisk DNA-bindende protein som fyller DNA hull i lagging strand replikering og excision reparasjon veier en.
Ankomsten av super-oppløsning fluorescens mikros muliggjør visualisering av molekylære strukturer i celler med nanometer oppløsning. Photoactivated Lokalisering Mikros (PALM) syssels fluorescerende proteiner som kan aktiveres fra en opprinnelig mørk tilstand til en fluorescerende tilstand (figur 2). Bare en undergruppe av alle merkede molekyler aktiveres til enhver tid å bestemme deres posisjoner på en sekvensiell måte, uavhengig av tHan total konsentrasjon av merkede molekyler i prøven 2.. Lokaliseringen presisjon per molekyl avhenger i hovedsak av størrelsen på den fluorescerende punktspredefunksjon (PSF), antall innsamlede fotoner, og bakgrunnen signal tre. Mange anvendelser av denne fremgangsmåte fokuserer på forbedret visualisering av cellulære strukturer. Realisering at PALM kan kombineres med single-molekyl sporing fire åpnet nye veier for å direkte følge bevegelsen av vilkårlig antall merkede proteiner i levende celler. Økt følsomhet og tidsmessig oppløsning av fluorescensmikroskoper nå tillate sporing av enkelt Diffusorelementene fluorescerende proteiner i bakteriens cytoplasma fem.
Her benytter vi PAmCherry, en konstruert fluorescerende protein som irreversibelt konverterer fra en innledende nonfluorescent tilstand til en fluorescerende tilstand ved bestråling med 405 nm lys seks. Aktivert PAmCherry fluoroforene kan være bilded etter eksitasjon ved 561 nm og spores i flere rammer før fotobleking. Vi demonstrerer evnen av fremgangsmåten for å identifisere transiente DNA-bindende arrangement av enkle proteiner ved bruk av en blanding av Pol1 og PAmCherry. Behandling av celler med metylmetansulfonat (MMS) forårsaker DNA metylering skade som er slått inn gapped DNA underlag med base-excision reparasjon enzymer. Vår metode viser tydelig binding av enkelt Pol1 molekyler som svar på MMS skade syv.
Vi diskuterer flere viktige hensyn for å lykkes med forsøket.
Valg og uttrykk for fluorescerende fusion protein: Det er en stor palett av photoactivatable og photoswitchable fluorescerende proteiner 17. Den spesifikke valget avhenger av mikroskopet egenskaper, spesielt lasere og filtre tilgjengelig. Kombinasjonen av 405 nm og 561 nm er ideell for vanlige photoactivatable fluorescerende proteiner. Vi valgte PAmCherry 6 fordi den er monomere og viste ingen aggregering i celler. Videre gir irreversibel fotoaktivering telling av antallet av aktiverte fluoroforer til å måle protein kopitall pr celle. I stedet for å uttrykke fusjonsproteinet fra plasmid, foretrekker vi kromosomal innsetting av genet som koder for fusjonsproteinet ved villtype-locus. Dette sikrer fullstendig utskifting av proteinet av interesse med det fluorescerende version og vedlikehold av villtype-ekspresjonsnivået.
Fotoaktivering rate: Det er viktig å justere fotoaktivering sats slik at i gjennomsnitt mindre enn ett molekyl per celle er i fluoriserende tilstand i noen ramme av filmen. Dette avhenger av 405 nm intensiteten og antallet molekyler igjen å bli aktivert. Ved svært lave bilde tettheter, men ikke alle molekyler vil bli fotografert før slutten av filmen eller svært lange filmer må være ervervet. Det antall rammer som er tatt opp pr film avhenger av kopitall av fusjonsproteiner pr celle og den midlere fotobleking levetid PAmCherry ved eksitasjon anvendte betingelser. Kopien antall Pol1 er ~ 400 molekyler / celle 1 og middelverdien av den eksponentielle fotobleking levetid fordelingen var ~ fire rammer. Ved å øke den 405 nm intensiteten gradvis, er aktiveringen jevnt fordelt over de 10.000 rammene av filmen. Derfor er occup hver celleIED av fluorescerende molekyler for totalt ~ 1600 rammer, noe som sikrer lite overlapping av PSFs og sporing komplikasjoner i en film på 10.000 rammer.
Eksponeringstid og eksitasjon intensiteter: Fremst, eksponeringstider må være tilstrekkelig kort for å observere skarpe PSFs med litt uskarpe bevegelser. Imidlertid bør det bildefrekvens velges for å gi observer molekylær bevegelse mellom suksessive rammer utover lokalisering usikkerhet, ellers viktige fotoner blir kastet bort ved oversampling sporet. Bevegelsen av ubundne molekyler må være samplet ved tilstrekkelig lange tidsintervaller som klart skilte seg ut fra den tilsynelatende bevegelse av bundne molekyler på grunn av lokaliseringen av usikkerhet. Da eksponeringstiden er angitt, skal PSF intensitet justeres. Lokaliseringen presisjon i en PSF øker med antall fotoner detektert over varigheten av en ramme. Høyere eksitasjon intensiteter øke foton emisjon rente but også fotobleking rate og bakgrunnssignal. Bruk laveste eksitasjon intensitet som gir den ønskede lokalisering presisjon. For Pol1-PAmCherry valgte vi 15,26 msek / ramme og 3,5 mW 561 nm eksitasjon (400 W / cm 2). Det er viktig å bekrefte cellelevedyktigheten for de bestemte avbildningsbetingelser ved å overvåke cellevekst og morfologi før og etter datainnsamling (se Tilleggsinformasjonen i Uphoff et al. 7).
Pol1 viser en bindende tid på ~ 2 sek til en gapped DNA substrat in vivo 7, vi forventer derfor flertallet av molekyler til å være enten i bundet eller ubundet tilstand for hele varigheten av et spor. Bundet molekyler vises hovedsak immobile fordi kromosom nettsteder har en diffusjonskoeffisienten flere størrelsesordener lavere (~ 10 -5 mikrometer 2 / sek, Elmore et al. 18) enn Pol1 diffusjon i cytoplasma (~ 1 mikrometer 2 </sopp> / sek).
Diffusion analyse: Den tilsynelatende diffusjonskoeffisienten D * beregnes fra MSD av enkeltspor, i gjennomsnitt over et minimum av fire trinn (5 rammer) for å redusere den statistiske feilen. Merk at ~ 75% av molekyler bleke i løpet av mindre enn fem rammer for imaging forholdene beskrevet. Slike korte spor ikke gir tilstrekkelig statistisk sikkerhet å skille mellom bundne og ubundne molekyler. Men de relative fraksjoner av bundne og ubundne molekyler som rapporterer om proteinaktivitet er uavhengig av det totale antall spor analysert.
Det er nyttig å redegjøre for PSF lokalisering feil (σ loc) i beregningen av D * fordi usikkerheten legger en tilsynelatende tilfeldig skritt til hver lokalisering av et molekyl 15.
For å forbedre klassifiseringen av bundne og Diffusorelementene molekyler, anbefaler vi beregne D * bott fra de enkeltvise forskyvninger og de forskyvninger over tid av to rammer. Det er da mulig å innstille to separate D * terskler: D * (15 msek) <0,15 mikrometer 2 / sek og D * (30 msek) <0,075 mikrometer 2 / sek.
Legg merke til at D * er en tilsynelatende diffusjon koeffisient som er berørt av celle innesperring av sporene og uskarpe bevegelser på grunn av diffusjon i løpet av eksponeringstiden. Hvis du vil trekke nøyaktige objektive diffusjonskoeffisienter, har det vist seg nyttig å sammenligne observert bevegelse til simulerte data basert på en stokastisk Brownske bevegelser modell 5,7. Simulerte data kan også bli brukt for å teste fremgangsmåten for dataanalyse.
Potensielle anvendelser av denne fremgangsmåte: Det beskrives en generell metode for visualisering og kvantifisering av protein-DNA-interaksjoner in vivo ved endringen i mobilitet av et protein ved binding til kromosom. Virksomheten til DNA-ellerRNA-bindende proteiner som er involvert i reparasjon, kan replikasjon, transkripsjon og kromosom vedlikehold således bli fulgt i sanntid på enkelt-celle-nivået med en romlig oppløsning under optisk diffraksjon grense. Photoactivated single-molekyl sporing strekker konvensjonelle sporingsmetoder som er begrenset til noen få merkede molekyler per celle. En alternativ metode som måler molekylær diffusjon in vivo er fluorescens Recovery Etter photobleaching (FRAP). Mens FRAP er meget nyttig for måling av globale diffusjon egenskaper i store celler, er det begrenset i sin evne til å løse flere molekylære arter med forskjellig mobilitet i et romlig heterogent miljø, spesielt for små bakterieceller.
Vi har søkt photoactivated single-molekyl sporing for å måle DNA-bindende aktiviteter og subcellulære lokaliseringer av en rekke forskjellige proteiner i E. coli inkludert Pol1, DNA ligase, Fis protein, DNApolymerase III 7, så vel som strukturell Vedlikehold av kromosomer proteiner MukB, E og F 19.. Vi antar at fremgangsmåten også kan tilpasses andre celletyper.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner Justin Pinkney og Johannes hohlbein for hjelp med byggingen av den spesialdesignede mikroskop og Seamus Holden for lokalisering programvare. Rodrigo Reyes-Lamothe takkes for å gi E. coli-stamme. Forskningen ble finansiert av EU-kommisjonen sjuende rammeprogram Grant FP7/2007-2013 HELSE-F4-2008-201418, UK Bioteknologi og Biological Sciences Research Council Grant BB/H01795X/1, og European Research Council Grant 261227 til ANK. DJS ble finansiert av en Wellcome Trust Program Grant WT083469. SU ble støttet av en MathWorks doc.
E.coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein | created by Lambda-Red recombination | ||
MEM amino acids | Invitrogen | 11130-051 | minimal medium supplement |
MEM vitamins | Invitrogen | 11120-052 | minimal medium supplement |
Agarose | BioRad | 161-3100 | certified molecular biology grade |
Microscope coverslips No 1.5 thickness | Menzel | BB024060SC | remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h |
Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma-Aldrich | 129925 | CAUTION: toxic |
PALM setup | home-built | described in Uphoff et al. 2013 | |
MATLAB | MathWorks | for data analysis and visualization | |
Localization software | custom-written, available online | http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html | MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al. 2010 if used in publication. |
Tracking software | available online | http://physics.georgetown.edu/matlab/ | MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker & Grier 1996 if used in publication. |