Tek molekül izleme ile kombine Fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) verir canlı Escherichia coli hücrelerinde protein-DNA etkileşimleri doğrudan gözlem ve ölçümü.
Protein-DNA etkileşimleri birçok temel hücresel süreçlerin merkezinde yer alıyor. Örneğin, DNA replikasyonu, transkripsiyon, onarım ve kromozom organizasyon In vitro deneyler, DNA-bağlayıcı proteinlerin birçok çeşit fonksiyonu için ayrıntılı modeller oluşturmak için yardımcı olmuştur. Spesifik DNA yapıları ya da dizileri tanıyan DNA bağlayıcı proteinler tarafından yönetilir, henüz edilir , canlı hücresinin karmaşık ortamda bu süreçlerin ve onların örgütün kesin mekanizmaları çok daha az anlaşılır kalır. Yakın zamanda Fotoaktive Localization Mikroskopisi tek molekül izleme ile birleştirilmiş (PALM) kullanılarak canlı Escherichia coli hücrelerinde DNA tamir faaliyetleri ölçülmesi için bir yöntem geliştirmiştir. Bizim genel yaklaşım kromozomu ile dernek üzerine tek bir proteinin hareketlilik değişiklikle bireysel DNA-bağlama olayları tanımlar. Bağlı moleküllerinin protein fraksiyonu hareket için bir doğrudan niceliksel ölçümünü sağlartek hücre düzeyinde ivity ve alt-tabakalar ya da bağlanma siteleri bolluk. Burada, biz yöntemi kavramını açıklamak ve örnek hazırlama, veri toplama ve veri analizi işlemlerini göstermektedir.
Bu protokol, Escherichia coli canlı hücreler protein-DNA etkileşimlerin doğrudan ölçülmesini anlatır. Bu kromozom (Şekil 1) bağlanan olarak teknik, tek bir floresan etiketli proteinin yayılma katsayısındaki bir değişiklik kullanır. Biz DNA polimeraz gecikmeli iplikçik çoğaltma ve eksizyon onarım yollar 1 DNA boşlukları doldurur I (Pol1), bir prototip DNA-bağlayıcı protein kullanmak yöntemini göstermek için.
Süper çözünürlüklü floresan mikroskopi gelişi nanometre çözünürlükte hücrelerde moleküler yapıların görüntülenmesini sağlar. Fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (PALM) bir floresan devlet (Şekil 2) için bir başlangıç karanlık durumdan aktif edilebilir floresan proteinleri kullanır. Sadece, tüm işaretli moleküllerin bir alt kümesi, bağımsız bir şekilde t, sıralı bir şekilde konumlarını belirlemek için herhangi bir zamanda devreyeo örnek 2'de işaretli moleküllerin konsantrasyonu toplam. Molekül başına lokalizasyonu hassas esas olarak floresan Point Spread Fonksiyonu (PSF) büyüklüğüne bağlıdır toplanmış, fotonların sayısı ve arka plan sinyali 3. Bu yöntemin bir çok uygulama hücresel yapıların görselleştirmenin geliştirilmesi üzerinde odaklanır. Izleme PALM tek molekül ile birleştirilebilir gerçekleştirilmesi 4, doğrudan canlı hücreler içinde etiketlenmiş proteinlerin rasgele sayı hareketini izlemek için yeni yollar açılmıştır. Artan duyarlılık ve floresan mikroskoplar zamansal çözünürlüğü şimdi bakteriyel sitoplazmada 5 tek difüzyon floresan proteinleri izlenmesine izin.
Burada, PAmCherry, geri dönüşü olmayan 405 nm ışık 6 ile ışıma üzerine bir floresan duruma özelliğine sahip olmayan bir başlangıç durumundan dönüştüren bir mühendislik floresan proteini kullanır. Aktive PAmCherry flüoroforlar görüntü olabilir561 nm uyarma ve photobleaching kadar birkaç kare için izlenen tarafından d. Biz Pol1 ve PAmCherry bir füzyon kullanan tek proteinlerin geçici DNA-bağlama olayları tanımlamak için yöntemin yeteneğini göstermektedir. Metil metansülfonat (MMS) ile hücrelerin tedavisi baz eksizyon onarım enzimleri ile aralıklı DNA alt tabakalar haline getirilmiştir DNA metilasyon hasara neden olur. Bizim yöntem MMS hasara 7 yanıt tek Pol1 moleküllerin bağlanma açıkça göstermektedir.
Biz deney başarısı için birkaç önemli konuları tartışmak.
Seçim ve floresan füzyon proteininin ifadesi: foto-aktifleştirilebilen ve photoswitchable floresan proteinleri 17 büyük bir palet bulunmaktadır. Özel seçim mikroskop özellikleri, mevcut özellikle lazerler ve filtreler bağlıdır. 405 nm ve 561 nm kombinasyonu yaygın ışıkla aktive floresan proteinleri için idealdir. Biz monomerik olduğu için PAmCherry 6 seçtik ve hücrelerde herhangi bir toplama gösterdi. Ayrıca, geri dönüşü olmayan bir foto-aktifleştirme hücre başına protein kopya sayısını ölçmek için aktif florofor sayısını sayma sağlar. Bunun yerine bir plazmidden füzyon proteini ifade nedeniyle, vahşi tip lokusta füzyon proteinini kodlayan genin kromozom ekleme tercih ederim. Bu floresan ettik ile ilgili proteinin tam yerine sağlarrsion ve vahşi tip ekspresyon seviyesini korur.
Foto-aktifleştirme oranı: Bu ortalama hücre başına daha az bir molekül filmin herhangi bir çerçeve içinde floresan halde olduğu gibi foto-aktifleştirme hızını ayarlamak için önemlidir. Bu, 405 nm yoğunluğuna bağlıdır ve moleküllerin sayısı etkinleştirilmesini yaptı. Çok düşük görüntüleme yoğunluklarda, ancak, tüm moleküller filmin sonundan önce görüntülenmiş olacak ya da çok uzun bir film satın gerekir. Filmin kaydedilen çerçeve sayısı hücre başına füzyon proteinleri ve ikinci uyarma koşullarında PAmCherry ortalama ışıkla ağartma ömür boyu kopya sayısına bağlıdır. Pol1 ait kopya sayısı ~ 400 molekül / hücre 1 ile üstel ışıkla ağartma süresi dağılımının ortalama değeri ~ 4 kare olmuştur. Kademeli olarak 405 nm yoğunluğunu arttırarak, aktivasyon eşit filmin 10000 çerçeveler üzerinden dağıtılır. Bu nedenle, her bir hücre occupPSFs ve 10,000 kare bir film izleme komplikasyonların küçük üst üste sağlanması, ~ 1.600 kare bir toplam floresan moleküller ile ied.
Pozlama süresi ve uyarım şiddetleri: En önemlisi, pozlama süreleri az hareket bulanıklığı ile keskin PSFs gözlemlemek için yeterince kısa olması gerekir. Ancak, kare hızı yerelleştirme belirsizlik ötesinde ardışık çerçeveler arasında gözlemlenebilir moleküler hareket verecek şekilde seçilmelidir, aksi takdirde önemli fotonlar takip oversampling tarafından israf edilmektedir. Bağlanmamış moleküllerinin hareketi lokalizasyonu belirsizlik nedeniyle bağlanan moleküllerin belirgin hareketi açıkça ayırt edilebilir olması için yeterince uzun bir zaman aralıklarında örneklenir gerekir. Maruz kalma süresi ayarlandığında, PSF şiddeti ayarlanabilir olmalıdır. PSF lokalizasyonu hassas bir çerçeve süresi boyunca algılanan fotonların sayısı ile artar. Yükseköğretim uyarma yoğunlukları foton emisyon oranı met artırmakt da photobleaching hızı ve arka plan sinyali. İstenilen yerelleştirme hassasiyet verir düşük uyarım yoğunluğunu kullanın. Pol1-PAmCherry için biz 15.26 msn / çerçeve ve 3,5 mW 561 nm uyarma (400 W / cm 2) seçti. Bu (Uphoff ve ark. 7 Tamamlayıcı bilgiler bakınız) veri toplama öncesi ve sonrası hücre büyümesini ve morfolojisi izleyerek belirli görüntüleme koşulları için hücre canlılığı teyit etmek önemlidir.
Pol1 in vivo 7 aralıklı bir DNA alt tabakasına ~ 2 sn bağlayıcı bir zamanı sergiler; bu nedenle moleküllerin çoğunluğu bir parçanın tüm süre boyunca ilişkili veya ilişkisiz devlet ya olmasını bekliyoruz. Kromozom siteleri sitoplazmada Pol1 difüzyon (~ 1 mikron 2 daha difüzyon katsayı büyüklüğü alt birkaç siparişleri (~ 10 -5 mikron 2 / sn, Elmore ve diğ. 18) çünkü bağlı moleküller aslında hareketsiz görünür </skadar> / sn).
Difüzyon analizi: görünür difüzyon katsayısı D * tek tek parçaları MSD hesaplanır, istatistiksel hatayı azaltmak için 4 adımda (5 kare) az üzerinde ortalama. O ~ moleküllerinin% 75 tanımlanan görüntüleme koşulları için en az 5 kare içinde çamaşır suyu edin. Gibi kısa parçalar ilişkili ve ilişkisiz molekülleri ayırt etmek için yeterli istatistiksel kesinlik vermemektedir. Bununla birlikte, protein aktivitesi rapor bağlanmış ve bağlanmamış moleküllerinin nispi fraksiyonları analiz parçaların toplam sayısının bağımsızdır.
Belirsizlik bir molekülün 15 her lokalizasyonu için belirgin bir rasgele adım ekler, çünkü D * hesaplanmasında PSF yerelleştirme hatası (σ loc) için hesap yararlıdır.
Bağlı ve difüzyon moleküllerin sınıflandırılması artırmak için, D * bot hesaplanması tavsiyeİki çerçeve, zaman içinde tek aşamalı değiştirmeler ve yer değiştirmeler h. Bu iki ayrı D * eşikleri ayarlamak mümkün olur: D * (15 msn) <0,15 mikron 2 / sn ve D * (30 msn) <0.075 mikron 2 / sn.
D * pozlama süresinde nedeniyle difüzyon bulanıklık parçaları ve hareket hücre hapsinde etkilenir belirgin difüzyon katsayısı olduğunu unutmayın. Doğru, tarafsız difüzyon katsayıları ayıklamak için, bir stokastik Brown hareketi modeli 5,7 dayalı simüle verilere gözlenen hareketini karşılaştırmak yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Simüle veriler de veri analizi prosedürlerini test etmek için kullanılır.
Bu yöntemin olası uygulamalar: Bu kromozoma bağlanması üzerine bir proteinin hareketliliğinde değişiklik ile in vivo koşullarında protein-DNA etkileşim görselleştirme ve miktarının belirlenmesi için genel bir yaklaşım açıklanmıştır. DNA-ya da etkinlikleriOnarımında yer alan RNA bağlayıcı proteinler, replikasyon, transkripsiyon ve kromozom bakım böylece optik kırılma sınırın altında bir uzamsal çözünürlük ile tek-hücre seviyesinde gerçek zamanlı olarak takip edilebilir. Fotoaktive tek molekül izleme hücre başına birkaç işaretli moleküllerin kısıtlanır geleneksel izleme yöntemlerinin uzanır. In vivo moleküler difüzyon ölçen alternatif bir yöntem (sıkı bağlamak) Photobleaching sonra Floresan Kurtarma olduğunu. FRAP büyük hücreler küresel difüzyon özelliklerini ölçmek için çok yararlı olsa da, özellikle küçük bakteri hücreleri için, uzamsal olarak heterojen bir ortamda farklı hareketlilik ile çeşitli moleküler türlerin çözmek için yeteneği sınırlıdır.
Bu DNA-bağlama aktiviteleri ve E içinde farklı protein bir dizi alt-hücresel lokalizasyon ölçmek için izleme ışıkla aktive edilen tek molekül uyguladık coli Pol1, DNA ligaz, FIS protein, DNA da dahil olmak üzerepolimeraz III 7, hem de kromozomlar protein MukB, E, ve F 19 yapısal bakımı. Bu yöntem aynı zamanda, diğer hücre tiplerine adapte edilebilir tahmin ediyoruz.
The authors have nothing to disclose.
Biz yerelleştirme yazılım için ısmarlama mikroskop ve Seamus Holden inşaatı ile yardım için Justin Pinkney ve Johannes Hohlbein kabul. Rodrigo Reyes-Lamothe E. sağlamak için teşekkür etti coli suşu. Araştırma Avrupa Komisyonu Yedinci Çerçeve Programı Hibe FP7/2007-2013 SAĞLIK-F4-2008-201418, UK Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi Grant BB/H01795X/1 ve ANK Avrupa Araştırma Konseyi Grant 261227 tarafından finanse edildi. DJS bir Wellcome Trust Programı Hibe WT083469 tarafından finanse edildi. SU Bir MathWorks doktora bursu ile desteklenmiştir.
E.coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein | created by Lambda-Red recombination | ||
MEM amino acids | Invitrogen | 11130-051 | minimal medium supplement |
MEM vitamins | Invitrogen | 11120-052 | minimal medium supplement |
Agarose | BioRad | 161-3100 | certified molecular biology grade |
Microscope coverslips No 1.5 thickness | Menzel | BB024060SC | remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h |
Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma-Aldrich | 129925 | CAUTION: toxic |
PALM setup | home-built | described in Uphoff et al. 2013 | |
MATLAB | MathWorks | for data analysis and visualization | |
Localization software | custom-written, available online | http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html | MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al. 2010 if used in publication. |
Tracking software | available online | http://physics.georgetown.edu/matlab/ | MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker & Grier 1996 if used in publication. |