Summary
Medições das propriedades de condução nervosa em vivo exemplificar uma ferramenta poderosa para caracterizar vários modelos animais de doenças neuromusculares. Aqui, apresentamos um protocolo de fácil e confiável pelo qual análise eletrofisiológica em nervo ciático de ratos anestesiados pode ser realizada.
Abstract
Estudos electrofisiológicos permitir uma classificação racional de várias doenças neuromusculares e são de ajuda, em conjunto com técnicas de neuropatológicos, na compreensão da patofisiologia subjacente 1. Aqui nós descrevemos um método para realizar estudos eletrofisiológicos no nervo ciático de rato in vivo.
Os animais são anestesiados com isoflurano, a fim de assegurar a analgesia para os ratinhos testados e não perturbada ambiente de trabalho durante as medições que levam cerca de 30 min / animal. A temperatura corporal constante de 37 ° C é mantida por uma placa de aquecimento e medida continuamente por uma sonda térmica rectal 2. Além disso, um eletrocardiograma (ECG) é rotineiramente registrada durante as medições, a fim de monitorar continuamente o estado fisiológico dos animais investigados.
Registros eletrofisiológicos são executadas no nervo ciático, o maior nervo do the sistema nervoso periférico (SNP), fornecendo o membro posterior do rato com feixes de fibras tanto motoras e sensoriais. No nosso protocolo, os nervos ciáticos permanecer in situ e, portanto, não têm de ser extraídos ou exposto, permitindo medições sem qualquer irritação nervosas adversas juntamente com gravações reais. Usando eletrodos de agulha apropriadas 3 realizamos tanto proximal e distal estímulos nervosos, registrar os potenciais de transmissão com eletrodos de sensoriamento no músculo gastrocnêmio. Após o processamento de dados, de confiança e valores altamente consistentes para a velocidade de condução nervosa (NCV) e do composto potencial de ação motor (CMAP), os principais parâmetros para a quantificação do funcionamento dos nervos periféricos bruto, pode ser alcançado.
Introduction
Medidas eletrofisiológicas são uma ferramenta indispensável para a investigação da integridade funcional dos nervos periféricos, tanto em ambientes clínicos e laboratoriais. Em seres humanos, um grande número de desordens neuromusculares e neuropatias diagnóstico dependem de medições electrofisiológicas. Ao medir as propriedades como velocidade de condução do nervo ou potenciais amplitudes do sinal, é possível caracterizar a origem áspero de doenças dos nervos periféricos.
A velocidade de condução nervosa é altamente dependente de propagação do sinal rápida ativada por mielinização. Portanto, os processos desmielinizantes geralmente apresentam diminuição velocidades de condução 4. O composto potencial de ação motor (CMAP) - correlacionando-se com o número de axônios funcionais - é um indicador de dano axonal quando reduziu significativamente 5.
Assim, por meio de métodos electrofisiológicos da etiologia da lesão do nervo periféricopode ser discriminado, tal como para as neuropatias hereditárias, neuropatia diabética 6,7 8,9, polineuropatias inflamatórias crónicas desmielinizantes (PDIC) 10, ou neuropatias metabólicas 11.
Normalmente, na aplicação humana são os preferidos gravações não-invasivos no nervo sural ou ulnar. Em camundongos, é muito simples para analisar propriedades nervosas do nervo ciático, o maior nervo do sistema nervoso periférico (SNP), contendo tanto grandes - e axônios de pequeno calibre do sistema motor e sensorial.
O procedimento como demonstrado aqui é um método rápido, fácil e confiável para medir todos os valores padrão relevantes para eletrofisiologia em nervos periféricos no rato intacto. Ao tomar gravações de um organismo preservados, são garantidas condições fisiológicas do ambiente do nervo.
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Protocol
O presente estudo foi realizado de acordo com a Lei de Proteção dos Animais da República Federal da Alemanha (Bundesrepublik Deutschland Tierschutzgesetz der) e foi aprovada pela Secretaria de Estado da Turíngia para a Segurança Alimentar e Defesa do Consumidor (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).
1. Definir as Medidas
- Anestesiar os ratos por isoflurano / O 2 inalação - para a iniciação de anestesia 3%, para a manutenção de 2% de isoflurano em 100% de oxigénio (Figura 1). Confirme anestesia suficientes, testando os reflexos simples, como reflexos de movimento e teste de sensibilidade para a dor de baixo grau. O uso de pomada para os olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia é recomendada, mas não indispensável, pois o procedimento normalmente leva apenas 30 min / animal no total. Em caso de experimentos de sobrevivência, administrar mais oportuna analgésicos de acção para controlar a dor pós-operatória.
- Raspar a pele que cobre as patas traseiras com um barbeador elétrico e realizar depilação com um creme de depilação disponíveis no mercado enquanto que os animais já estão sob analgesia. A fim de manter o status de livre de patógenos durante todo o procedimento, use luvas de assepsia e sempre utilizar instrumentos cuidadosamente limpos com etanol 70%.
- Controle de estabilidade de temperatura do corpo por uma placa de aquecimento controlado de feedback e sonda térmica retal (Figura 2). Se necessário, utilize um campo estéril para cobrir a placa de aquecimento entre os animais, a fim de manter um ambiente estéril experimental. Além disso, recomenda-se usar uma placa de aquecimento, o qual é controlado electronicamente por meio de um sensor integrado para limitar a temperatura de aquecimento para ≤ 40 ° C, a fim de evitar danos no tecido.
Figura 1. Expconfiguração erimental mostrando um rato anestesiado com membros posteriores raspadas. - Tome eletrocardiograma (ECG) para monitorar a freqüência cardíaca como um parâmetro vital. Instalar três eléctrodos para ECG, como segue: um eléctrodo sob a pele de cada um dos membros anteriores e um eléctrodo sob a pele na área do pescoço.
- Eletrodos coloque o anel usando contato gel para ótima resistência condutividade / transferência. O eléctrodo de detecção (rotulado de preto) é colocado na posição em que o músculo do gastrocnémio tem o seu diâmetro máximo. O eletrodo de referência (indicado em vermelho) é colocado logo abaixo do eletrodo de detecção.
Nota: Por favor, veja 'table material' para obter detalhes de equipamentos. - Marque as posições corretas de medição com pré-determinados, mas consistentes distâncias entre o proximal e distal a estimulação do nervo ciático eo eletrodo de chumbo. Proposta Experimental: A uma distância de 4 mm do eletrodo sensor, o estímulo distal ocorrerá.A uma distância de 16 mm e o eléctrodo de detecção, a estimulação proximal será realizado (Figura 2).
Figura 2. Imagem representativas mostrando a situação experimental apenas antes do inicio das medições. A seta branca indica a posição do meio de detecção (preto) e referência (vermelho) do eléctrodo no músculo gastrocnémio da pata posterior esquerda. A estimulação por eléctrodos de agulha vai ser realizada em posições definidas em relação ao eléctrodo de detecção preto. O ponto de estímulo distal (marca preta com "DS" no membro posterior esquerdo) tem uma distância de 4 mm do eletrodo sensor; o lugar da estimulação proximal (marca preta com "ps") é 16 milímetros de distância. A linha vermelha na pata traseira direita mostra a aproximadamente Imate curso anatômica do nervo ciático. Além disso, as posições aproximadas de músculos dos membros posteriores relevantes são mostrados como pontos de referência. O asterisco indica que a sonda térmica retal.
2. Medição
- Princípio: Realizar uma série de estímulos nervosos com repetitivamente gerados pulsos de 0,1 ms de duração por monopolar descartáveis eletrodos de agulha 28 g de onda quadrada simples (taxa de repetição de 200 ms; ver Figura 3A). Para a análise de dados fora de linha, é recomendado para adquirir simultaneamente sinais de estimulação, juntamente com a curva de resposta da função neuromuscular (Figura 3B), devido à estimulação do nervo. Média, uma série de respostas máximas ("representante resposta função neuromuscular") para posterior análise de dados. A fim de produzir dados confiáveis, ficha e posteriormente média pelo menos três curvas de resposta independentes, ótimo por local de estimulação e animal.
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Figura 3. Procedimento para a aquisição de dados e análise (representação esquemática). Impulsos repetitivos gerados são aplicados para o nervo isquiático através de eléctrodos em agulha (linha superior na Figura 3A). Simultaneamente, várias curvas de resposta neuromuscular correspondentes são registadas (linha inferior na Figura 3A). Quando a média e ampliada, as curvas de resposta neuromuscular devido a pulsos de estimulação (linha superior na Figura 3B) mostram as seguintes propriedades características de linha inferior (na Figura 3B): Latência da resposta do sinal, bem como a duração e a amplitude do sinal estão indicados e pode ser obtido para cálculos e estatísticas posteriores. Condução de sinal irregular e / ou gravações com qualidade inferior normalmente resulta em várias deformações de sinal com mais do que apenas um positivo e outro negativo deflexão ou deformação do sinal(Forma bimodal) com amplitude reduzida (Figura 3C). - Realizar estimulação proximal com um eléctrodo de agulha na posição determinada ("MA" na Figura 2).
- A fim de alcançar melhores condições de gravação com amplitudes máximas, visualizar as curvas de resposta reais em simultâneo com o processo de estimulação. Ao fazê-lo, o experimentador é capaz de avaliar imediatamente a forma das curvas de resposta, assim como o tamanho da amplitude.
- Se necessário, ligeiramente e cuidadosamente manipular a posição e / ou o ângulo da agulha em relação à estimulação do nervo ciático. Esta optimização suave condições de estimulação permite atingir amplitudes constantes com o maior valor possível, e uma curva de resposta de forma típica bifásica (Figura 4).
- Realizar estimulação distal com um eléctrodo de agulha na posição determinada ("DS" na Figura 2).
- Após completion da medição, transferir o mouse testado para uma gaiola separada até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não deixe um animal autônoma e na companhia de outros animais até que ele está totalmente recuperado da anestesia. Administrar oportuna mais analgésicos de acção para controlar a dor pós-operatória. A administração sistêmica de medicamentos anti-inflamatórios não esteróides (AINE) e opióides são recomendados para 1-3 dias.
- Alternativamente, sacrificar o mouse ainda anestesiados de forma rápida e mais humanos, sem dor para o animal, por exemplo, por deslocamento cervical.
Figura 4. Ilustração para determinar as gravações CMAP com amplitudes máximas. Uma série de registo completo é apresentado. (Um (B) os resultados do movimento agulha estimulação leve em gravações CMAP com amplitudes máximas. (C) mudanças adicionais na colocação da agulha produzir gravações CMAP com diferentes amplitudes, incluindo quase máxima amplitudes. (D) Estimulação substituição da agulha com gravações CMAP série de amplitudes quase máximos. Nota: decremento típica em amplitudes CMAP pode ocorrer durante a estimulação repetitiva no local estimulação óptima 12, 13. Os asteriscos indicam gravações CMAP com amplitudes máximas representadas por média.
3. Análise
- Extraia parâmetros de condução nervosa com base no conjunto neuromuscular representante resposta função de dados usando um pacote de software adequado (por exemplo, AtisaPro).
Nota: lidar com a determinação de dados relacionados com o tempo, com um cuidado especial, pois a determinação do ponto de inflexão do composto pot ação motoracial (CMAP) início e término pode ser difícil. Um procedimento com reprodutibilidade verificado é dado na Figura 3B, onde são usados tangentes sobre desvios de sinal após o início e antes do término. - Calcular 'latência de sinal "e valores" CMAP'.
- Latência 'representa o intervalo de tempo entre estímulo e CMAP início, ao passo que o intervalo de tempo entre o início da CAMP deflexão negativa inicial para rubricar retorno à linha de base é chamado de' duração CMAP '. Utilizar a diferença entre latências distais e proximais para calcular a velocidade de condução junto com a distância entre sítios de estimulação proximal e distal.
A velocidade de condução = latência / distância entre sítios de estimulação - CMAP '(composto potencial de ação motor) amplitude representa a magnitude entre o ponto de viragem máximo positivo e negativo do sinal de CMAP (dada em mV).
CMAP = value 'positivo ponto de viragem "- valor" negativo po reviravoltaint '
- Latência 'representa o intervalo de tempo entre estímulo e CMAP início, ao passo que o intervalo de tempo entre o início da CAMP deflexão negativa inicial para rubricar retorno à linha de base é chamado de' duração CMAP '. Utilizar a diferença entre latências distais e proximais para calcular a velocidade de condução junto com a distância entre sítios de estimulação proximal e distal.
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Representative Results
Foi realizada uma série de medições in vivo eletrofisiológicos no nervo ciático de 12 ratos no total para este estudo: 6 animais de cada sexo. As medições foram realizadas com o protocolo apresentado e entregues os seguintes resultados:
Ambos os ratos machos e fêmeas exibir uma velocidade de condução do nervo ciático média de cerca de 20 m / s (Figura 5). Isto é consistente com outras medidas na literatura. Além disso, mostra que não há diferenças relevantes na velocidade de condução nervosa entre machos e fêmeas de acordo com os nossos dados.
Figura 5. Nerve velocidades de condução do nervo ciático medido para ratos macho e fêmea in vivo.
Figura 6. Amplitudes CMAP após proximal (roxo) e distal (vermelho) estimulação do nervo ciático in vivo.
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Discussion
O protocolo descrito fornece um método fácil e confiável para determinar propriedades de condução do nervo ciático em ratos anestesiados, sem a necessidade de expor o nervo de interesse. No entanto, este procedimento experimental provoca lesão tecidual por punção da agulha. Por isso, é uma opção razoável para sacrificar os animais depois de terminar as gravações. No entanto, em comparação com outros procedimentos invasivos que exigem a exposição do nervo antes da gravação, o dano tecidual é comparativamente pequeno 3,14. Portanto, as medidas repetidas são possíveis e dependem da concepção do respectivo estudo. No entanto, certos pontos tem que ser considerada, de modo a assegurar resultados consistentes.
Para realizar ótimas condições de gravação, é importante para reduzir a resistência da pele, depilação completa, extensa limpeza de pele e usando gel de contacto, que permite uma adequada baixo nível de ruído / contaminação durante measurements.
Além disso, é importante procurar óptimas formas de curvas bifásicas, dos sinais detectados, conforme mostrado na Figura 3B. Ocasionalmente, também detectar curvas que são, obviamente, um produto de condução de sinal irregular através antidrome sinal difundir ou por alguns ramos nervosos. Este cenário resulta em diferentes deformações de sinal com mais do que apenas um positivo e outro negativo ou deflexão com uma forma de sinal de divisão, reduzida amplitude, e / ou sinal alargado (Figura 3C). A fim de assegurar a propagação de sinal orthodrome clássica do ponto de estimulação para o músculo, apenas esses registos devem ser utilizados para as quantificações que exibem uma forma clara, como mostrado na Figura 3B.
Deve ser tido em conta que a anestesia podem influenciar registos electrofisiolicos em nervos periféricos. Relatórios anteriores indicam que a utilização de isoflurano para umanesthesia reduz valores CMAP acentuadamente, em comparação com a medição CMAP em condições nonanesthetized 14. No entanto, o procedimento é aqui utilizado tem um impacto mínimo na NCV, proporciona dados reprodutíveis ao longo do desempenho experimental e é o método mais seguro, mais eficaz da anestesia, a fim de avaliar a função do nervo periférico em ratos 15.
Finalmente, há que se considerar que o nervo ciático contém feixes de fibras tanto motoras e sensoriais. Uma análise separada de qualquer motor ou componentes sensoriais é impossível por causa do usado aqui estimulação do nervo externo supra-maximal e induziu propagação do sinal orthodrome. A fim de resolver este problema, nós também realizada registros eletrofisiológicos de nervo sural 16, um nervo sensorial pura que pode ser estimulada no tornozelo lateral traseira membro do mouse. No entanto, o pequeno tamanho do nervo sural conduz aos seguintes problemas: Em primeiro lugar, normalmente uma vez smatamanho potencial ll durante as gravações podem ser obtidas que exigia a análise de dados sofisticada. Em segundo lugar, um certo número de ferimentos acidentais do nervo sural em estudo devido a punção não pode ser evitado durante a tentativa de realizar gravações.
Em contraste com outros protocolos de 17, que não é necessário extrair o nervo de interesse - no nosso caso, o nervo ciático - antes das medições. Ao tomar gravações de um organismo preservados, são preservadas as condições fisiológicas do ambiente nervo intacto. Além disso, o dano no tecido dos ratos é pequeno em comparação com os procedimentos mais invasivos.
Por outro lado, a falta de exposição do nervo usando esta técnica torna reprodução consistente de estímulos mais difícil uma vez que a confirmação visível de colocação do eléctrodo adequada com respeito ao nervo ciático não é possível. Contudo, a monitorização simultânea das curvas de resposta durante recordings é uma maneira fácil de definir de forma confiável adequado posicionamento agulha estimulação.
Usando este método, vários modelos novos e existentes do rato de doenças neuromusculares podem ser devidamente caracterizados em termos de propriedades de condução nervosa: fenótipos Desmielinizantes pode ser claramente distinguida de modelos animais de doenças, principalmente musculares ou axonal, por exemplo, como mostrado em um trabalho anterior onde o descrito método foi realizado 7.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo SFB 604, DFG MO 1421/2-1 e Krebshilfe 107089 (para HM). AS é destinatário de um Prêmio Jovem Investigador de Tumor das Crianças Foundation (Nova York, EUA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Concentric Needle Electrodes (Stimulation) | Natus Medical Incorporated, San Carlos, CA, USA | 9013S0901 | |
| Digital Ring Electrodes (Recording) | Natus Medical Incorporated, San Carlos, CA, USA | 9013S0302 | |
| ToM - Tower of Measurement (A/D converter) | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany | ||
| AtisaPro, data acquisition and analysis software | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany | ||
| HSE-Stimulator T | Hugo Sachs Elektronik, Hugstetten, Germany |
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