Summary
Metingen van zenuwgeleiding eigenschappen in vivo illustreren een krachtig hulpmiddel om te karakteriseren verschillende diermodellen van neuromusculaire ziekten. Hier presenteren we een eenvoudig en betrouwbaar protocol waarmee elektrofysiologische analyse van heupzenuwen van verdoofde muizen kunnen worden uitgevoerd.
Abstract
Elektrofysiologische studies maken een rationele classificatie van verschillende neuromusculaire ziekten en zijn hulp met neuropathologische technieken, in het begrijpen van de onderliggende pathofysiologie 1. Hier beschrijven we een werkwijze voor elektrofysiologische studies op muis heupzenuwen optreden in vivo.
De dieren worden verdoofd met isofluraan om analgesie zorgen voor de geteste muizen en ongestoord werkomgeving tijdens de metingen die ongeveer 30 min / dier nemen. Een constante lichaamstemperatuur van 37 ° C wordt gehandhaafd door een verwarmingsplaat en continu gemeten met een rectale sonde thermo 2. Tevens wordt een elektrocardiogram (ECG) routinematig opgenomen tijdens de metingen om de fysiologische toestand van de onderzochte dieren continu meten.
Elektrofysiologische opnames worden uitgevoerd op de heupzenuw, de grootste zenuw van the perifere zenuwstelsel (PNS), het verstrekken van de muis achterste ledematen met zowel motorische en sensorische vezels traktaten. In ons protocol, heupzenuwen blijven situ en dus niet te worden verwijderd en blootgesteld, waardoor metingen zonder nadelige zenuw irritatie met opnames. Met behulp van geschikte naald elektroden 3 voeren we zowel proximale en distale zenuw stimulaties, registreren de uitgezonden potentials met voelelektroden op gastrocnemius spieren. Na verwerking, betrouwbare en zeer consistente waarden voor de zenuwgeleidingssnelheid (NCV) en de verbinding motor actiepotentiaal (CMAP), de belangrijkste parameters voor het kwantificeren van de bruto perifere zenuwen functioneren, kan worden bereikt.
Introduction
Elektrofysiologische metingen zijn een onmisbaar instrument voor het onderzoeken van de functionele integriteit van de perifere zenuwen in zowel klinische als laboratorium-omgevingen. Bij mensen een groot aantal neuromusculaire aandoeningen en neuropathieën diagnostisch afhankelijk elektrofysiologische metingen. Door het meten zenuw eigenschappen geleidingssnelheid of mogelijke amplituden van het signaal, is het mogelijk om de ruwe oorsprong van perifere zenuwen ziekten kenmerken.
De zenuw geleidingssnelheid sterk afhangt van snelle signaaloverdracht ingeschakeld myelinisatie. Daarom demyeliniserende processen algemeen tonen daalde geleidingssnelheden 4. De verbinding motor actiepotentiaal (CMAP) - correleren met het aantal functionele axonen - is een indicator voor axonale schade als aanzienlijk verminderd 5.
Dus door middel van elektrofysiologische werkwijzen de etiologie van perifere zenuwbeschadigingkunnen worden onderscheiden, zoals erfelijke neuropathieën 6,7, 8,9 diabetische neuropathie, chronische inflammatoire demyeliniserende polyneuropathieën (CIDP) 10 of metabole neuropathieën 11.
Normaal gesproken, in de toepassing op de mens niet-invasieve opnamen op de sural of nervus ulnaris voorkeur. Bij muizen is eenvoudig zenuw eigenschappen van sciatic zenuwen, de grootste zenuw van het perifere zenuwstelsel (PNS) die zowel grote analyseren - en klein kaliber axonen van de motorische en sensorische systeem.
De procedure zoals hier aangetoond is een snelle, eenvoudige en betrouwbare methode om alle standaard waarden relevant voor elektrofysiologie op de perifere zenuwen in de intacte muis meten. Door het nemen van opnames van een beschermd organisme, zijn fysiologische omstandigheden van de zenuw milieu gegarandeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De huidige studie werd uitgevoerd volgens de Dierenbescherming wet van de Bondsrepubliek Duitsland (Tierschutzgesetz der Bundesrepublik Deutschland) en werd goedgekeurd door de Thüringer State Bureau voor voedselveiligheid en consumentenbescherming (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).
1. Instellen van de metingen
- Verdoven de muizen met isofluraan / O 2 inhalatie - voor inleiding van anesthesie 3%, een onderhoud 2% isofluraan in 100% zuurstof (figuur 1). Bevestig voldoende verdoving door het testen van eenvoudige reflexen zoals beweging reflexen en het testen van de gevoeligheid voor low-grade pijn. Het gebruik van zalf op de ogen tot droog tijdens de anesthesie te voorkomen wordt aanbevolen, maar niet noodzakelijk omdat de procedure duurt gewoonlijk slechts 30 min / dier in totaal. In het geval van overleving experimenten, beheren tijdige langer werkende analgetica voor het beheer van postoperatieve pijn.
- Scheer de vacht die de achterste ledematen met een elektrisch scheerapparaat en voer ontharen met een commercieel verkrijgbaar hair-removal crème terwijl dieren zich reeds onder analgesie. Om-pathogeen-vrije status gedurende de hele procedure te handhaven, dragen aseptische handschoenen en altijd gebruiken instrumenten zorgvuldig gereinigd met 70% ethanol.
- Controle lichaamstemperatuur stabiliteit door een feedback verwarmingsplaat en rectale thermo sonde (figuur 2). Indien nodig, gebruik dan een steriel laken om de verwarming plaat tussen de dieren te dekken om een steriele experimentele omgeving te houden. Voorts wordt aanbevolen een verwarmingsplaat, die elektronisch wordt aangestuurd via een geïntegreerde sensor om de verwarmingstemperatuur naar ≤ 40 ° C om weefselbeschadiging te voorkomen beperken gebruiken.
Figuur 1. Experimental setup die een verdoofde muis met geschoren achterpoten. - Neem elektrocardiografie (ECG) opnames om de hartslag als een vitale parameter monitoren. Plaats drie elektroden voor ECG-registraties als volgt: een elektrode onder de huid van elke voorpoot en een elektrode onder de huid in de nek.
- Plaats ringelektroden behulp contact gel voor een optimale weerstand geleiding / overdracht. De meetelektrode (geëtiketteerd zwart) wordt geplaatst op de positie waar de gastrocnemius zijn maximale diameter. De referentie-elektrode (aangegeven in rood) wordt geplaatst net onder de detectie-elektrode.
Opmerking: zie 'Materiaal tabel' voor apparatuur details. - Markeer de juiste positie van de meting met voorafbepaalde maar constante afstand tussen de proximale en distale heupzenuw stimulatie en de leidende elektroden. Experimentele voorstel: Op een afstand van 4 mm van de meetelektrode, het distale stimulatie plaats.Bij een afstand van 16 mm aan de meetelektrode, zal het proximale stimulatie uitgevoerd (Figuur 2).
Figuur 2. Vertegenwoordiger showing experimentele situatie vlak voor het begin van de metingen. De witte pijl geeft de positie van de sensor (zwart) en referentie (rode) elektrode aan de gastrocnemius spier van de linker achterpoot. De stimulatie door naald elektroden op welbepaalde plaatsen worden uitgevoerd met betrekking tot de zwarte meetelektrode. Het punt van distale stimulatie (zwarte vlek met "ds" aan de linker achterpoot) heeft een afstand van 4 mm van de registratie-elektrode; de plaats van proximale stimulatie (zwarte vlek met "ps") is 16 mm afstand. De rode lijn op de rechter achterpoot toont de ca. Imate anatomische verloop van de nervus ischiadicus. Bovendien is de ruwe posities van relevante achterste ledematen spieren worden als oriëntatiepunten. Het sterretje geeft de rectale thermische sonde.
2. Meting
- Principe: Voer een reeks van zenuwprikkels met herhaaldelijk gegenereerd enkele blokvormige pulsen van 0,1 msec duur door monopolar besteedbaar 28 G naald elektroden (herhalingsfrequentie 200 msec, zie figuur 3A). Voor off-line data-analyse, is het raadzaam om stimulatie signalen samen tegelijk te verwerven met de neuromusculaire functie response curve (Figuur 3B) als gevolg van zenuwstimulatie. Gemiddeld een reeks maximale reacties ("vertegenwoordiger neuromusculaire functie respons") voor verdere data-analyse. Om betrouwbare gegevens, opnemen en later gemiddeld ten minste 3 onafhankelijke, optimale respons curves per stimulatieplaats en dier te produceren.
p_upload/51181/51181fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51181/51181fig3.jpg "/>
Figuur 3. Procedure voor data-acquisitie en-analyse (schematische voorstelling). Worden herhaaldelijk gegenereerde pulsen toegepast op de heupzenuw via naald elektroden (bovenste rij in figuur 3A). Tegelijkertijd worden meerdere overeenkomstige neuromusculaire respons curven opgenomen (onderste rij in figuur 3A). Bij gemiddeld en vergroot, neuromusculaire reactie curven door stimulatiepulsen (bovenste rij in figuur 3B) tonen de volgende kenmerkende eigenschappen (onderste rij in Figuur 3B): Wachttijd van het signaal zelf en duur en amplitude van het signaal worden aangegeven en kan worden verkregen voor daaropvolgende berekeningen en statistieken. Onregelmatige signaal geleiding en / of suboptimale opnames meestal resulteren in verschillende signaal vervormingen met meer dan alleen een positieve en een negatieve uitslag of signaal vervorming(Bimodale vorm) met verminderde amplitude (figuur 3C). - Voer proximale stimulatie met een naald elektrode bepaalde positie ("ps" in figuur 2).
- Om de beste opname-omstandigheden met een maximale amplitudes te bereiken, visualiseren de werkelijke respons curven gelijktijdig op de stimulatie proces. Hierdoor de experimentator kan de vorm van de respons curves en de grootte van de amplitude direct beoordelen.
- Indien nodig, licht en nauwkeurig de positie en / of de hoek van de stimulatie naald ten opzichte van de heupzenuw manipuleren. Deze zachte optimalisering van stimulatiecondities maakt bereiken constante amplitudes met de grootst mogelijke waarde en een responscurve typische tweefasige vorm (figuur 4).
- Voer distale stimulatie met een naald elektrode bepaalde positie ("ds" in figuur 2).
- Na completion van de meting, de overdracht van de geteste muis om een aparte kooi totdat het voldoende weer bij bewustzijn is om borstligging handhaven. Heeft een dier niet zonder toezicht en in het gezelschap van andere dieren te verlaten totdat deze volledig is hersteld van anesthesie. Dien tijdig langer werkende analgetica voor het beheer van postoperatieve pijn. Systemische toediening van niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID's) en opioïden worden aanbevolen voor 1-3 dagen.
- Als alternatief, offeren de nog steeds verdoofd muis op een snelle en humane manier zonder verdere pijn voor het dier, bijvoorbeeld door nek dislocatie.
Figuur 4. Illustratie aan de CMAP opnames met maximale amplitudes te bepalen. Een volledige registratie serie wordt gepresenteerd. (A (B) Lichte stimulatie naald beweging resulteert in CMAP opnames met maximale amplitudes. (C) Verdere wijzigingen in plaatsing van de naald produceren CMAP opnamen met verschillende amplitudes waaronder bijna maximaal amplitudes. (D) Stimulatie vervangen van de naald met seriële CMAP opnames van bijna maximaal amplitudes. Opmerking: Typisch verlagen in CMAP amplitudes kunnen optreden tijdens de repetitieve stimulatie op optimale stimulatie plaats 12, 13. Sterretjes geven CMAP opnames met maximale amplitudes weergegeven voor middeling.
3. Analyse
- Extract zenuwgeleiding parameters op basis van de representatieve neuromusculaire functie respons dataset met behulp van een geschikt softwarepakket (bijv. AtisaPro).
Opmerking: Behandel-tijd gerelateerde gegevens bepaling met bijzondere zorg, omdat buigpunt bepaling van compoundmotor actie potpreferentiële (CMAP) aanvang en beëindiging kan moeilijk zijn. Een procedure met geverifieerde reproduceerbaarheid is in figuur 3B, waarbij raaklijnen op doorbuiging signaal na het begin en voor de beëindiging worden gebruikt. - Bereken 'signaal latency' en 'CMAP' waarden.
- Latency 'is de tijd die verstrijkt tussen stimulatie en CMAP begin, terwijl de tijdspanne tussen CAMP begin van de eerste negatieve uitslag op de initiële terugkeer naar de basislijn heet' CMAP duur '. Met het verschil tussen distale en proximale latenties om geleidingssnelheid samen berekent de afstand tussen distale en proximale stimulatieplaatsen.
geleidingssnelheid = latency / afstand tussen stimulatieplaatsen - CMAP '(compound motor actiepotentiaal) amplitude stelt de grootte tussen de maximale positieve en negatieve ommekeer punt van de CMAP signaal (uitgedrukt in mV).
CMAP = waarde 'positieve ommekeer punt' - waarde 'negatieve ommekeer point '
- Latency 'is de tijd die verstrijkt tussen stimulatie en CMAP begin, terwijl de tijdspanne tussen CAMP begin van de eerste negatieve uitslag op de initiële terugkeer naar de basislijn heet' CMAP duur '. Met het verschil tussen distale en proximale latenties om geleidingssnelheid samen berekent de afstand tussen distale en proximale stimulatieplaatsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben een reeks in vivo elektrofysiologische metingen heupzenuwen van 12 muizen in totaal voor deze studie: 6 dieren van elk geslacht. De metingen werden uitgevoerd met de gepresenteerde protocol en leverde de volgende resultaten:
Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen vertonen een gemiddelde heupzenuw geleidingssnelheid van ongeveer 20 m / sec (Figuur 5). Dit is consistent met andere metingen in de literatuur. Bovendien blijkt dat er geen relevante verschillen in zenuwgeleiding snelheid tussen mannen en vrouwen volgens onze gegevens.
Figuur 5. Zenuwgeleidingen van de nervus ischiadicus gemeten voor mannelijke en vrouwelijke muizen in vivo.
Figuur 6. CMAP amplitudes na proximale (paars) en distale (rood) stimulatie van de nervus zenuw in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven protocol biedt een eenvoudige en betrouwbare methode om heupzenuw geleiding eigenschappen op verdoofde muizen te bepalen zonder de noodzaak om de zenuw van belang bloot. Toch is deze experimentele procedure veroorzaakt weefselschade door naaldpunctuur. Het is dus een redelijk alternatief voor de dieren offeren na het beëindigen van de opnamen. In vergelijking met andere meer invasieve procedures, waarbij de blootstelling van de zenuw voor opnames nodig weefselbeschadiging is relatief klein 3,14. Daarom herhaalde metingen mogelijk en afhankelijk van het ontwerp van de onderscheiden studies. Echter, bepaalde punten moeten worden overwogen om consistente resultaten te waarborgen.
Om optimale opnameomstandigheden voeren, is het belangrijk om de huidweerstand te verminderen door volledige ontharing uitgebreide schoonmaking en door contact gel, die toelaat een zo laag geluidsniveau / contaminatie tijdens MEAsurements.
Verder is het belangrijk om optimale, bifasische kromme vormen van de gedetecteerde signalen zoals getoond in figuur 3B. Af en toe, we sporen ook curves die duidelijk een product van onregelmatige signaal geleiding door antidrome signaal verspreiden of door een zenuw takken. Dit scenario leidt tot verschillende signaal vervormingen met meer dan alleen een positieve en een negatieve uitslag of met een split signaal vorm, verminderde amplitude en / of verbreed signaal (Figuur 3C). Om de klassieke orthodrome signaalvoortplanting verzekeren van het punt van stimulatie van de spier, dient alleen opnamen worden gebruikt quantifications dat een duidelijke vorm zoals in figuur 3B weergegeven.
Er moet rekening mee worden gehouden dat anesthesie elektrofysiologische opnames kunnen beïnvloeden perifere zenuwen. Eerdere rapporten aangegeven dat het gebruik van isofluraan voor eennesthesia vermindert CMAP waarden aanzienlijk, vergeleken met CMAP meting onder nonanesthetized omstandigheden 14. Toch is de hierin gebruikte procedure een minimale impact op NCV levert reproduceerbare gegevens van alle praktische uitvoering en is de veiligste en meest effectieve methode van anesthesie om de perifere zenuw functies beoordelen muizen 15.
Tot slot moet men van mening dat de heupzenuw bevat zowel motorische en sensorische vezels traktaten. Een afzonderlijke analyse van zowel motorische of zintuiglijke componenten is onmogelijk, omdat van de hierin gebruikte externe supra-maximale zenuwstimulatie en geïnduceerde orthodrome signaalvoortplanting. Om dit probleem aan te pakken, voerden we ook elektrofysiologische opnames van suralis 16, een puur sensorische zenuw die kan worden gestimuleerd op de laterale enkel van de muis achterste ledematen. De kleine omvang van de suralis leidt tot de volgende problemen: Ten eerste, gewoonlijk een vrij small potentiële omvang tijdens de opnamen kunnen worden verkregen die geavanceerde data-analyse nodig. Ten tweede kan een aantal ongevallen letsel van de suralis bestudeerde door prikken niet voorkomen terwijl het proberen om opnames te verwezenlijken.
In tegenstelling tot andere protocollen 17, is het niet nodig om de zenuw plaats extract - in ons geval de heupzenuw - voor de metingen. Door het nemen van opnames van een beschermd organisme, zijn fysiologische omstandigheden van de intacte zenuw omgeving bewaard. Bovendien weefselbeschadiging bij de muizen klein in vergelijking met meer invasieve procedures.
Anderzijds, het gebrek aan licht zenuw deze techniek maakt consistente weergave van stimulaties moeilijker, omdat zichtbare bevestiging van de juiste plaatsing van de elektroden ten opzichte van de heupzenuw niet mogelijk. Echter, gelijktijdige controle van de respons curves tijdens RecorDings is een gemakkelijke manier om een goede stimulatie naald positionering betrouwbaar definiëren.
Met deze methode kan verschillende bestaande en nieuwe muismodellen neuromusculaire ziekten goed worden gekarakteriseerd in termen van zenuwgeleiding eigenschappen: Demyeliniserende fenotypes kan duidelijk worden onderscheiden van diermodellen van voornamelijk spier of axonale ziekten, bijvoorbeeld zoals in een eerder werk waarbij de beschreven methode is uitgevoerd 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door SFB 604, DFG MO 1421/2-1 en Krebshilfe 107.089 (HM). AS is ontvanger van een Young Investigator Award van de Children's Tumor Foundation (New York, USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Concentric Needle Electrodes (Stimulation) | Natus Medical Incorporated, San Carlos, CA, USA | 9013S0901 | |
| Digital Ring Electrodes (Recording) | Natus Medical Incorporated, San Carlos, CA, USA | 9013S0302 | |
| ToM - Tower of Measurement (A/D converter) | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany | ||
| AtisaPro, data acquisition and analysis software | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany | ||
| HSE-Stimulator T | Hugo Sachs Elektronik, Hugstetten, Germany |
References
- Kimura, J. 3rd ed. Electrodiagnosis in Diseases of Nerve and Muscle. , Oxford University Press. (2001).
- Rutkove, S. B. Effects of temperature on neuromuscular electrophysiology. Muscle Nerve. 24, 867-882 (2001).
- Xia, R. H., Yosef, N., Ubogu, E. E. Dorsal caudal tail and sciatic motor nerve conduction studies in adult mice: technical aspects and normative data. Muscle Nerve. 41, 850-856 (2010).
- Zielasek, J., Martini, R., Toyka, K. V. Functional abnormalities in P0-deficient mice resemble human hereditary neuropathies linked to P0 gene mutations. Muscle Nerve. 19, 946-952 (1996).
- Raynor, E. M., Ross, M. H., Shefner, J. M., Preston, D. C. Differentiation between axonal and demyelinating neuropathies: identical segments recorded from proximal and distal muscles. Muscle Nerve. 18, 402-408 (1995).
- Pareyson, D., Scaioli, V., Laura, M. Clinical and electrophysiological aspects of Charcot-Marie-Tooth disease. Neuromol. Med. 8, 3-22 (2006).
- Schulz, A., et al. Merlin isoform 2 in neurofibromatosis type 2-associated polyneuropathy. Nat. Neurosci. 16, 426-433 (2013).
- Lamontagne, A., Buchthal, F.
- Andersen, H., Nielsen, J. F., Nielsen, V. K. Inability of insulin to maintain normal nerve function during high-frequency stimulation in diabetic rat tail nerves. Muscle Nerve. 17, 80-84 (1994).
- Magda, P., et al. Comparison of electrodiagnostic abnormalities and criteria in a cohort of patients with chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Arch. Neurol. 60, 1755-1759 (2003).
- Lindberg, R. L., et al. Motor neuropathy in porphobilinogen deaminase-deficient mice imitates the peripheral neuropathy of human acute porphyria. J. Clin. Invest. 103, 1127-1134 (1999).
- Massey, J. M.
- Stalberg, E., Falck, B.
- Osuchowski, M. F., Teener, J., Remick, D. Noninvasive model of sciatic nerve conduction in healthy and septic mice: reliability and normative data. Muscle Nerve. 40, 610-616 (2009).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neurosci. Lett. 483, 127-131 (2010).
- Dilley, A., Lynn, B., Pang, S. J. Pressure and stretch mechanosensitivity of peripheral nerve fibres following local inflammation of the nerve trunk. Pain. 117, 462-472 (2005).
- Vleggeert-Lankamp, C. L., et al. Electrophysiology and morphometry of the alpha- and beta-fiber populations in the normal and regenerating rat sciatic nerve. Exp. Neurol. 187, 337-349 (2004).
